松材线虫病又名松树枯萎病，是由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)引起的一种毁灭性森林病害，可危害36种松属植物和8种非松属植物。该病发展速度快，死亡率高，被称为“森林癌症”。已有的组织病理学研究表明，松树对松材线虫侵染的第一个明显组织病理学反应是其皮层和木质部的轴向和射线薄壁细胞的死亡。感染松材线虫病的植株最终因木质部管胞空穴化导致水分疏导功能受阻而枯萎死亡，而管胞栓塞的产生和空穴化则是由木质部薄壁细胞变性死亡引起的(Sugawa, 1982；Mamiya，1985；Fukuda et al., 1997)。

细胞死亡可分为2种基本类型：细胞程序性死亡或细胞凋亡(protrammed cell death，PCD)和细胞坏死(necrosis)，前者是一种生理性的细胞死亡，是由个体自身基因控制的细胞主动死亡过程(Kerr et al., 1972)；而后者是细胞在遭受到强烈有害刺激时出现的一种被动的、突发性的死亡。PCD作为生物体内广泛存在的一种机体自我调整机制，是生命活动的一个重要组成部分，近年来受到广泛关注。本研究从寄主植物细胞死亡方式的角度，研究分析松材线虫病早期寄主薄壁细胞是否发生程序性死亡，以揭示松材线虫的致病机制。

对检测外界因子诱导植物PCD，已有的报道大都采用DNA片段分析等生化检测或是电镜观察(林久生等，2000；苏金为等，2002；金刚等，2006)。本研究采用碘化丙锭荧光显微技术，按时间进程和与接种点距离的不同分段采样分析，以确定在松材线虫病感染早期寄主薄壁细胞发生的变化及其引起寄主细胞死亡的方式。

1 材料与方法 1.1 接种虫株

供试的松材线虫来源于浙江自然感病的马尾松(Pinus massoniana)。经贝曼分离技术分离松材线虫(方中达，1998)，消毒处理后，于灰葡萄孢(Botrytis cinerea)菌落上25 ℃下培养6~7 d后，备用。

1.2 接种材料

1年生黑松(Pinus thunbergii)实生苗，平均苗高15 cm，直径(茎中段)0.3 cm，购自当地苗圃，于培养室内适应生长1个月后待用。

1.3 接种方法

选取生长基本一致的1年生黑松幼苗，采用人工皮接法接种。即用锋利的解剖刀在梢头下约1.5 cm处的茎干一侧向下纵切一呈“T”字型的伤口，长约0.5 cm，深达木质部，撕开韧皮部，用封口膜在伤口部位围成一小漏斗，放入一合适大小的脱脂棉球，然后用微量进样器注入线虫悬浮液(接种量约为每株1 800条)，以注射无菌水做对照A组。再用透明胶布固定并封住漏斗上部保湿，置25~30 ℃下生长，定期浇水。另设对照B组，不做伤口，而且始终不浇水，使其缺水而自然干枯。

1.4 荧光显微技术 1.4.1 石蜡切片制备

分别于接种后12、24、36、…、204、228 h每隔12 h定期对处理和对照A组分段取样。对照B组待其萎蔫的形态与接种线虫的松苗外部症状相似时取样，取样部位与接种材料一致。

以接种部位为参照，自接种部位最低点向下每隔0.5 cm切取0.5 cm茎段做分析样品，纳瓦兴Ⅲ固定液(1%铬酸:10%醋酸:福尔马林10 mL:蒸馏水40 mL=3:2:1:4)中固定24 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚度7 μm。

1.4.2 碘化丙锭荧光染色

染色液配制：碘化丙锭(propidium iodide, PI, 购自上海华舜生物工程有限公司)5 mg，RNA酶(无DNA酶活性)100 mg，含0.1% TritonX-100的PBS缓冲溶液(购自南京生兴生物技术有限公司)100 mL，将碘化丙锭溶于缓冲液后，加入RNA酶避光保存。

染色步骤：将干燥后的石蜡切片按常规脱蜡，经梯度乙醇逐级降低入蒸馏水中洗；PI荧光染色液室温下避光染色30 min。染色后Leica301-185.104-000荧光显微镜镜检，>600 nm激发光下观察, Canon Powershot 550照相。

2 结果与分析 2.1 松材线虫病早期寄主薄壁细胞死亡方式

PI荧光染色观察结果表明，1年生黑松苗接种线虫后，其皮层薄壁细胞出现了明显的细胞凋亡特征：首先是细胞核内的染色质出现不规则凝集，进而凝集加剧，细胞核开始变形(图版Ⅰ-1)，浓缩的染色质集中分布在核周围，中间出现无DNA的区域(图版Ⅰ-2)，导致致密的、分离的、边界清晰的半月形的染色质颗粒集中于核膜边缘(图版Ⅰ-3)；染色质浓缩过程伴随有核膜及细胞膜的内陷，形成瘤状突起突出到核外形成凋亡小体(图版Ⅰ-4、5)，最后核膜消失，核碎裂成大小不等的圆形小体，并被细胞膜所包绕(图版Ⅰ-6)，最终细胞内充满凋亡小体，而细胞核周只剩下少量DNA残余(图版Ⅰ-7、8)。整个过程中细胞膜完整性不断丧失，通透性不断增加，细胞核染色逐渐加深或变亮黄，而细胞壁完整，胞浆内含线粒体等细胞器形态较完整，稳定性较高。对照A组皮层薄壁细胞形态健康正常，表现为细胞核圆形或椭圆形，呈现均匀明亮的红色荧光，线粒体等细胞器形态清晰完整(图版Ⅰ-9)。对照B组皮层薄壁细胞则大面积普遍表现为坏死的形态特征，细胞核核形较完整，但被PI染色后发出强烈的亮黄色荧光，表明膜完整性已丧失，细胞质溶解释放，细胞器损坏或消失，且无凋亡小体形成(图版Ⅰ-10)。

2.2 松材线虫病早期寄主薄壁细胞凋亡的变化规律

通过对寄主组织随接种时间的推移分段取样观察发现：松树感染松材线虫后，体内薄壁细胞凋亡现象不是偶然出现的，也不是在某一茎段出现的。它不仅发生在接种点附近，而且在线虫还没有移动到的远离接种点的部位，其组织细胞也出现了明显的细胞凋亡特征。尤其是皮层薄壁细胞发生程序性死亡的数量和程度是随着时间的推移和线虫在松苗体内不断扩散分布而逐步增加的。

相同接种时间，细胞凋亡的数量和程度与距离接种点的远近有关，离接种点越近，发生凋亡的细胞数量越多。当接种12 h时，松苗接种点附近(0.5~1 cm)少量皮层薄壁细胞已经明显表现出早期凋亡的特征，而远离接种点部位(5.5~6 cm)的细胞还未出现可见的凋亡现象；接种48 h后，当5.5~6 cm部位的部分皮层薄壁细胞的细胞核已有可见的染色质固缩和新月形凝集于核膜一边时，0.5~1 cm部位的皮层薄壁细胞已经有较多细胞进入了凋亡的晚期。之后，发生程序性死亡的细胞陆续增多，松苗组织褐变纵向由远及近变深，横向由内及外变深。但是随着接种时间的推进，细胞凋亡程度的不断加重，与接种点距离远近的差别就日渐缩小。到接种120 h的时候，整株松苗茎部的皮层薄壁细胞都已表现凋亡晚期的特征。

同样，与接种点距离相同部位的细胞其发生凋亡的数量和程度与接种时间的长短有关。本研究从接种12 h后开始取样，发现在0.5~1 cm处个别散在的皮层薄壁细胞此时已经表现出细胞凋亡的特征，表明松材线虫侵染最初引起的寄主细胞程序性死亡的发生时间是12 h或更早些，而这些发生程序性死亡的薄壁细胞细胞壁完整，显然没有受到线虫的直接机械损坏。之后，随着时间推进，表现出凋亡特征的细胞愈来愈多，但即使是同一部位相邻的几个细胞，其表现凋亡的程度也不一定相同，往往是既有凋亡早期细胞又有凋亡晚期细胞，或者是凋亡晚期细胞与死亡细胞并存，而此时大多数树脂道泌脂细胞都未出现明显病变。接种120 h时，树脂道泌脂细胞和射线细胞相继破坏死亡，随后，形成层和髓部细胞也陆续表现出明显的病变死亡，线虫开始大面积扩散，直至228 h时，松苗茎部所有的轴向和射线薄壁细胞都已死亡，细胞器消失，形成层和髓部的细胞也普遍死亡，皮层中多数细胞破裂严重，出现大面积空洞。

3 讨论

形态学观察是鉴定细胞凋亡的基本方法，人们常用光学显微镜和电子显微镜来检测凋亡。电镜观察是证明PCD最可靠的方法，可观察细胞的超微结构，可以同时反应细胞的完整性、细胞质中细胞器的改变、细胞核及染色质的改变、“凋亡小体”的形成等。但其观察视野小，而植物发生PCD的细胞数比率小，持续时间短，有时序性，研究难度相对要大。本研究是对松材线虫侵染引起寄主细胞死亡方式的首次分析，需要大量取样观察，在没有明确时间与部位的前提下，选择光学显微镜观察较为适宜。本研究中尝试了PI荧光染色法来检测植物细胞凋亡，PI染色液可与细胞核DNA染色，在>600 nm激发光下显示出PCD中细胞核的变化。试验表明PI单染法可以用于检测植物细胞程序性死亡。

虽然凋亡与坏死有本质的区别，且通常把凋亡与坏死看成是细胞相互排斥的选择，即细胞要么凋亡要么坏死，但是，在一定条件下又有一定的联系。大量试验表明：凋亡与坏死可相继发生，许多因素如氧自由基，既可以引起凋亡也可以引起坏死，在一定条件下凋亡模式的死亡可以转化为坏死模式的死亡(程尉新等，1998)。松材线虫作为一种生物因子可能对寄主植物产生了某中程度的胁迫。当植物受到胁迫时，会因为胁迫程度的不同而表现为坏死或程序性死亡，DNA被随机降解还是被有规律的降解成DNA梯是2种死亡方式的重要区别(Mittler et al., 1995)。越来越多的证据表明活性氧和抗氧化酶参与了细胞的程序性死亡过程(Jabs, 1999)。在参与细胞程序性死亡的活性氧和抗氧化酶中，通常认为H₂O₂和CAT是最重要的，使H₂O₂增加或者抑制CAT的表达都能引起细胞的程序性死亡(McCabe et al., 1997)，氧化应激介导PCD的可能机制是活性氧、自由基直接通过影响基因转录，改变细胞的表型特征，或作用于细胞膜，诱发膜脂过氧化，从而影响细胞的信号传递，激发有关的基因调控，导致细胞凋亡(李忌等，1997)。

陈玉惠(2002)研究发现，黑松幼苗接种松材线虫后，早期(12 h)膜脂过氧化产物MDA(丙二醛)含量增加较缓慢，后期(72 h)累积大幅加速。MDA是膜脂质过氧化的主要产物之一，其含量的增加可以表示细胞膜脂质过氧化程度的加重，同时伴随着细胞质膜相对透性的增加。线虫侵染也可导致黑松幼苗内超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性的变化，接种早期SOD在12 h活性有所增加，12 h后开始小幅度下降，至72 h时则大幅下降；CAT则是12 h时活性降低，72 h后大幅度下降。SOD和CAT是植物机体内清除活性氧、自由基的抗氧化酶，其活性大幅下降意味着清除能力减弱，造成活性氧、自由基的累积。在镉诱导的茶树细胞程序性死亡中，随诱导时间的延长，茶树幼苗体内SOD、CAT和MDA也发生了类似的活性变化趋势，镉胁迫下，幼苗膜脂过氧化可能是诱发PCD的主要原因。生物体受到胁迫时，会因为胁迫程度的不同而表现为坏死或PCD，低浓度活性氧、自由基诱导细胞凋亡，高浓度则导致细胞坏死(苏金为等，2002)。在松材线虫侵染引起寄主细胞PCD中，活性氧和抗氧化酶是否参与了早期薄壁细胞的程序性死亡过程，发展期细胞的命运如何，是否转化为细胞坏死，值得进一步探讨。

植物界关于细胞程序性死亡的研究处于起步阶段，目前研究大都限于确定PCD现象的存在，至于它如何受控于细胞基因，在什么生理状态下启动，还知之甚少。尽管如此，本研究首次在细胞形态学基础上对松材线虫侵染感病寄主后早期细胞死亡的方式进行了检测，并结合细胞死亡的过程做了较系统的对比和分析，发现寄主细胞病变的数量和程度变化与线虫的侵染扩散之间有一定的规律可循，为松材线虫病侵染感病寄主早期可诱发植物PCD过程提供了细胞学证据。这些结果对进一步确定寄主细胞死亡的病因和阐明松材线虫病致病机理具有十分重要的意义。