2. 内蒙古科技大学包头师范学院
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YIN Jing1 隐孢子虫(Cryptosporidium)和贾第鞭毛虫(Giardia)(简称“两虫”)是两种重要的介水和食物传播的病原虫，也可以通过与动物接触、人与人接触进行传播。“两虫”可导致以腹泻为主要临床表现的人畜共患性原虫病，老人、婴幼儿、免疫功能低下等人群是易感人群，目前对“两虫”感染疾病并无有效治疗措施[1-4]。研究发现，感染“两虫”的人群均可表现为无症状携带者[5]，可能成为潜在的传染源，因此，研究“两虫”健康人携带率是反映人群两虫感染的重要组成部分。研究表明：“两虫”具有在人—畜之间传播的可能性，感染了“两虫”的牲畜是潜在的传染源[6-7]。内蒙古包头达茂旗地区是我国主要畜牧区之一，牛、羊不仅是该地区主要的畜牧牲畜，也是隐孢子虫和贾第鞭毛虫的主要宿主，因此能够密切接触牛、羊等动物的牧区儿童，可能具有较高的“两虫”感染风险。目前，研究人员更多关注于有临床症状的婴幼儿及学龄前儿童的“两虫”感染情况，对表观健康学龄儿童的“两虫”感染情况研究较少见[2]。为了解牧区儿童“两虫”的携带情况，本研究于2018年6月以内蒙古包头达茂旗地区牧区生源的中低年级小学生为调研对象开展了“两虫”感染的调查研究，从而为控制和预防牧区“两虫”相关疾病的发生提供基础资料。
1 材料与方法 1.1 仪器和试剂4%石炭酸复红染液(石炭酸，分析纯，天津市大茂化学试剂厂公司；碱性复红，分析纯，天津市文达稀贵试剂化工厂)；3%盐酸乙醇溶液(盐酸、95%乙醇，天津市大茂化学试剂厂)；2%孔雀石绿染液(孔雀石绿，分析纯，天津市文达稀贵试剂化工厂)；卢戈氏碘液(碘，分析纯，天津市文达稀贵试剂化工厂；碘化钾，分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司)为实验室配制。正置显微镜(日本Olympus公司)。
1.2 调查对象按照行政区划，该地区可分为旗镇和镇外的牧区，牧区生源的学龄儿童均在同一所小学接受教育。调查人员选择了该校牧区生源的全部在校小学生，共计191人进行两虫感染调查。调查获得学校知情同意。
1.3 样本采集粪便采用一次性粪便收集盒进行收集并标注调查对象信息。由家长协助收集调查对象的粪便样本，使用无“两虫”污染的一次性粪便收集盒采集儿童新鲜粪便(10~20) g/份，所有粪便样品低温保存，并于24 h内送至实验室。
1.4 样本检测粪便进行涂片、固定、染色和镜检。隐孢子虫卵囊检测染色采用改良抗酸染色法，贾第鞭毛虫孢囊检测采用卢戈氏碘液染色[8]。对阳性及可疑标本，重新涂片、染色、镜检，并经2人鉴定即确诊为阳性。具体步骤如下：将粪便样品涂布到载玻片上，使透过粪膜能模糊的看到玻片下的文字，涂布好的粪膜用甲醇固定，用改良抗酸染色法进行染色：先用石炭酸复红染液染色20 min后，用清水冲洗玻片1 min；再用盐酸乙醇溶液进行脱色1 min，必要时可以重复脱色一次，清水冲洗玻片1 min；最后用孔雀石绿染液染色1 min，清水冲洗玻片1 min，待干后镜检。贾第鞭毛虫孢囊采用卢戈氏碘液染色法：向涂布好的粪膜上滴加卢戈氏碘液，加盖玻片，用显微镜观察。镜下隐孢子虫卵囊成直径(2~6) μm的玫红色近圆形卵囊，贾第鞭毛虫呈直径(8~14) μm的棕色椭圆形包囊，囊内可见折光物。
1.5 质量控制进行调查前对调查员进行培训，明确调查表的填写方法，对有效调查表和有效样品纳入统计，对有疑问的调查表和样品进行二次核查。
采样前对检测员进行培训，规范样品采集、样品检测和结果报告方法，实验严格按照操作流程进行，使用隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫包囊阳性对照(Waterborne公司)分别进行改良抗酸染色和卢戈氏碘液染色镜检，镜下能观察到玫红色的隐孢子虫卵囊和棕色的贾第鞭毛虫包囊，检测人员正确掌握“两虫”形态、大小等识别特征。
1.6 统计分析应用WPS 2017录入数据，SPSS 19.0进行统计分析，用卡方检验分析男生和女生之间感染率的差异，以及隐孢子虫和贾第鞭毛虫之间感染率的差异。检验水准α=0.05，以P < 0.05判断差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 学生基本情况本次调查共采集小学生粪便样本191份，学生年龄在(7~13)岁，其中男生110人，女生81人。
2.2 隐孢子虫和贾第鞭毛虫感染情况在191份学生粪便样本中，隐孢子虫检测为阳性的样本71份，隐孢子虫感染率为37.2%(71/191)；贾第鞭毛虫检测为阳性的样本28份，贾第鞭毛虫感染率为14.7%(28/191)；其中，隐孢子虫感染率高于贾第鞭毛虫感染率，两者之间差异有统计学意义(χ2=26.388，P < 0.01)。检出“两虫”混合感染的样本11份，混合感染率5.8%(11/191)。隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫包囊形态见图 1。
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| 注：a中箭头所示为隐孢子虫卵囊质控抗酸染色(标尺为10 μm)；b中箭头所示为儿童粪便中隐孢子虫卵囊抗酸染色(标尺为10 μm)；c中箭头所示为贾第鞭毛虫质控碘液染色(标尺为20 μm)；d中箭头所示为儿童粪便中贾第鞭虫碘液染色(标尺为20 μm) 图 1 隐孢子虫和贾第鞭毛虫染色结果 |
2.3 不同性别学生隐孢子虫和贾第鞭毛虫感染率比较
男生隐孢子虫感染率(40.0%，44/110)略高于女生(33.3%，27/81)，两者之间差异无统计学意义(χ2=0.888，P=0.346>0.05)。男生贾第鞭毛虫感染率(14.5%，16/110)略低于女生(14.8%，12/81)，两者之间差异无统计学意义(χ2=0.003，P=0.959>0.05)。男生隐孢子虫和贾第鞭毛虫混合感染率(7.3%，8/110)略高于女生(3.7%，3/81)，两者之间差异无统计学意义(χ2=1.095，P=0.360>0.05)。男生和女生的隐孢子虫感染率分别高于各自的贾第鞭毛虫感染率，差异有统计学意义(χ男生2=17.967，P < 0.05；χ女生2=7.598，P < 0.05)
3 讨论隐孢子虫和贾第鞭毛虫是常见人畜共患寄生性病原虫，人群感染后的临床表现以腹痛、腹泻等胃肠道症状为主，也可以是无症状的[4-5]，对于低龄儿童、老人及艾滋病患者等免疫功能低下人群，也可能表现为慢性的、甚至危及生命的严重腹泻[1, 8]。隐孢子虫和贾第鞭毛虫在全球各地均有检出，每年多次导致人群暴发腹泻，其中隐孢子虫是导致暴发腹泻的最主要原虫[8-9]。
我国研究人员在对人群粪便中隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测中发现，隐孢子虫和贾第鞭毛虫在多个城市和地区均有检出，平均感染率为1%~3%，乡村检出率高于城市，农牧区更高，儿童感染率高于成人[2, 4, 10-12]。本次调查的小学生隐孢子虫携带率为37.2%(71/191)，贾第鞭毛虫感染率为14.7%(28/191)，高于一般人群和文献中儿童的检出率[10, 13-14]。这可能与牧区人群生活习惯有关，牧区人群居住分散，市政供水管网覆盖率较低，大部分家庭使用自备井水，甚至人畜共用，卫生条件差，而隐孢子虫和贾第鞭毛虫被认为是介水、食物和接触传播导致腹泻的主要病原虫，人群可以通过接触和饮用隐孢子虫和贾第鞭毛虫污染的水而感染。同时，牧区畜牧养殖普遍，多数家庭养殖牛、羊等牲畜，这些牲畜是“两虫”的主要宿主[15]，尤其是奶牛，被认为是造成人感染隐孢子虫的来源[16]，儿童抵抗力低下，更容易被感染。此外，可能也与牧区人群日常生活中的卫生知识了解程度低，对隐孢子虫和贾第鞭毛虫感染防范意识不足有关。
本次调查不同性别学生“两虫”的感染率差异没有统计学意义，这与研究人员在江苏省、重庆市等地的调查报道相一致[4, 17]。
调查还发现牧区小学生存在一定比例的“两虫”混合感染，感染率5.8%(11/191)。Frhat在利比亚某城市开展的腹泻儿童的肠道病原微生物检测结果表明，仅在(6~9)岁年龄组有4名患儿检出“两虫”混合感染，感染率0.8%(4/505)[1]。我国调查人员发现饮用水、奶牛中存在一定程度的“两虫”混合感染情况[6]，同样存在不同亚种隐孢子虫或不同集聚体贾第鞭毛虫的混合感染[14, 18]，或与其他病原虫发生混合感染的情况[19]，因此“两虫”混合感染需要引起关注。本次调查的结果提示当地相关部门需重视牧区人群卫生状况、提高居民健康意识，加强牧民卫生安全的基础设施建设。
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