抗生素主要以原药、代谢产物等形式排出体外，通过生活污水排放、养殖废水排放、农业粪肥灌溉径流等不同途径进入环境水体，近年来，在国内外的不同环境水体中均检出抗生素^[1-4]。残留的抗生素给环境水体中的微生物带来巨大的选择性压力，对生态系统中各类生物产生危害，并可能在环境和生物体中累积或者通过食物链富集，诱发和传播各类抗生素耐药菌及抗生素抗性基因，严重威胁人类健康^[5-8]。

进入环境水体的抗生素种类多、性质差别大，且多以痕量浓度存在，故检测难度较大。目前检测方法主要包括生物传感器检测、酶联免疫吸附检测(ELISA)、高效液相色谱—荧光检测(HPLC-FLD)、高效液相色谱—紫外检测(HPLC-UV)及高效液相色谱串联质谱检测(HPLC-MS/MS)^[9-20]。

本文选取了使用范围广、用量大且有途径进入东江水源水的大环内酯类、氟喹诺酮类、林可胺类、β-内酰胺类及四环素类5类共14种抗生素为目标检测物，应用固相萃取技术，采用HLB柱进行富集浓缩，用HPLC-MS/MS进行检测，建立了一种灵敏、准确、可靠、可同时检测环境水样中14种抗生素的检测方法，并应用方法首次对东莞市东江水的抗生素污染情况进行调查，结果检出包括大环内酯类、氟喹诺酮类及林可胺类3类共6种抗生素。

1 材料与方法 1.1 仪器、试剂与材料

3200 QTRAP液质联用仪(ESI源，美国AB SCIEX公司)；CPA225D电子天平(瑞士Sartorius公司)；Fotector plus 60自动固相萃取仪(含大体积进样装置，美国Reeko公司)；自动氮吹仪(韩国GOOJUNG公司)；SevenEasy S20 pH计(瑞士METTLER TOLEDO公司)；Oasis HLB固相萃取柱(500 mg/6 mL，美国waters公司)；Millipore S.A.S超纯水机(德国Meck公司)。

甲醇、乙腈及丙酮(色谱纯，德国Meck公司)、甲酸(色谱纯，美国Fluka公司)；盐酸(优级纯，天津科密欧化学试剂有限公司)、乙二胺四乙酸钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；试验用水为Millipore S.A.S处理过的超纯水。大环内酯类：阿奇霉素(AZ，纯度94.3%，下同)、罗红霉素(EM，96.0%)、克拉霉素(CLR，97.5%)；氟喹诺酮类：左氧氟沙星(LEV，97.3%)；林可胺类：克林霉素(DA，84.9%)、林可霉素(MY，85.5%)；β-内酰胺类：青霉素(PEN，93.1%)、阿莫西林(AMC，86.9%)、氨苄西林(AM，86.5%)、舒他西林(STA，72.0%)、氯唑西林(OB，91.0%)、哌拉西林(PIP，95.9%)、双氯西林(DIC，纯度98.0%)；四环素类：土霉素(OTC，88.8%)；以上标准品除双氯西林购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司外，其余13种均购自中国食品药品检定研究院。

标准品贮备液和标准曲线溶液的制备：分别称取以上14种标准品，用甲醇溶解并定容于50 mL棕色容量瓶中，配成200 mg/L的标准品贮备液，置-20 ℃冰箱保存；取各标准品贮备液适量，用初始流动相稀释制成所需浓度的标准曲线工作溶液，注意临用新制。

1.2 仪器条件

1.2.1 色谱条件

CAPCELL PAK MGⅢ C₁₈色谱柱(100 mm × 2.0 mm，3 μm，日本资生堂)，进样体积10 μL，柱温35℃，流速为0.2 mL/min，流动相A乙腈，流动相B为0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱程序如下表 1。

1.2.2 质谱条件

电离方式采用电喷雾正离子(ESI+)模式，质谱以多反应监测(MRM)模式扫描；电离电压(IS)为+5 500 V；喷雾管雾化气(Gas1)、辅助加热气(Gas2)流速均为345 kPa、气帘气(CurtainGas)为172 kPa、辅助加热温度为550 ℃；各化合物质谱参数见表 2。

1.3 样品前处理

环境水样经0.45 μm微孔滤膜过滤后，准确量取1 000 mL，加入0.5g Na₂EDTA，超声振荡使溶解，再用10%盐酸调节pH值为3.0；上样前，依次用10 mL甲醇、5 mL超纯水及5 mL 0.1%甲酸水溶液活化Oasis HLB固相萃取柱(6 mL/500 mg)；然后以6 mL/min流速经HLB柱进行目标物富集；用12 mL超纯水淋洗小柱，气推后用10 mL甲醇以1 mL/min的速率洗脱。收集的洗脱液在35 ℃下氮气吹干，加初始比例流动相1 mL溶解，过0.22 μm滤膜，供HPLC-MS/MS分析。

2 结果与讨论 2.1 样品前处理条件优化

2.1.1 水样pH值

水样经加入Na₂EDTA后pH约为5，考虑到部分目标抗生素在偏碱性环境中稳定性较差，故用稀盐酸及氨水将水样调节pH值至2.0~7.0，考察其对目标物回收率的影响。结果表明，pH值为3.0时，14种目标物的综合回收率为最佳。

2.1.2 固相萃取条件 2.1.2.1 固相萃取小柱

选择HLB、反向硅胶(C₁₈)、混合型阳离子(MCX)、混合型阴离子(MAX)不同类型及规格的萃取柱进行比较，分别考察它们对目标抗生素的回收率。结果显示，HLB柱对目标物的富集效果最好，且体积容量较大的6 mL/500 mg HLB柱对于大体积样品的回收率较高，重复性好。

2.1.2.2 洗脱溶剂种类及体积

选择甲醇、乙腈、二氯甲烷和丙酮四种试剂进行洗脱效果比较，结果表明，丙酮及乙腈仅对大环内酯类和四环素类抗生素的洗脱效果好；二氯甲烷毒性较大且易挥发，对极性成分洗脱能力较差；而甲醇对5类抗生素的洗脱能力较为平均，对目标物的综合回收率较高，且基质效应少，故选择甲醇为洗脱溶剂。对甲醇的洗脱体积的研究结果表明，当洗脱体积大于10 mL后，目标物回收率无明显提高，因此确定其洗脱体积为10 mL。

2.2 色谱条件优化

选取了6种不同品牌和规格的色谱柱进行考察，综合考虑其响应值、分离效果及稳定性等，最终选择Capcell Pak MGⅢ C₁₈(100 mm×2.0 mm，3μm)柱，其分离效果良好，灵敏稳定。

流动相的pH值对目标物的分离具有重要影响，且正离子模式电离中，适量添加酸有利于提高目标物的离子化效率，得到较高的灵敏度。经考察，选择0.1%甲酸水溶液为流动相B；此外分别比较了甲醇、乙腈、0.1%甲酸甲醇及0.1%甲酸乙腈作为流动相A对14种抗生素的分离效果，结果表明乙腈作为流动相A时响应及峰型最佳，故最终选定乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱，程序如项表 1，14种抗生素的质量色谱图见图 1。

2.3 线性范围及检出限

在优化的实验条件下，14种目标抗生素均可得到良好的响应及分离。以目标物质量浓度为x，峰面积为y，绘制标准曲线，各成分分别在约(2~1 000) μg/L(相当于水样2~1 000 ng/L)范围内有良好的线性关系，相关系数均大于0.99；以信噪比(S/N)3 :1所对应浓度折算方法检出限(LOD)(表 3)。

2.4 方法的回收率与精密度

分别以阴性对照(超纯水)及东江水样品为基底，分别按10 ng/L及100 ng/L的质量浓度水平进行加标实验，按1.3项下制备样品，平行测定6份，其回收率及精密度测定结果见表 4。14种目标检测物在两种基底中的平均加标回收率分别为62.0%~96.1%和58.5%~113.3%，相对标准偏差分别为1.7%~11.4%和1.4%~9.6%，表明该方法具良好的准确度和精密度。

2.5 实际样品的测定

采用所建立的方法，对东莞市城区段东江3个采样点表层水中抗生素进行监测(表 5)。可见3个采样点的水样中分别检出大环内酯类、氟喹诺酮类及林可胺类抗生素，与文献报道^{[1, 3-4, 14-20]}的国内其它水体抗生素污染的类别及成分有所区别。水体中检出LEV的最高浓度达46.7 ng/L，抗生素总量浓度范围为(38.95~100.7) ng/L，说明该段河流水体受到抗生素的污染，其生态影响需进一步研究。

3 小结

本文采用固相萃取—高效液相色谱—串联质谱联用法，对水中14种抗生素同时进行定性定量测定，所建立的方法灵敏度高、准确度好、稳定性强，可应用于环境水样中抗生素污染情况调查及其分布规律研究。