, , , 菌落总数是水质微生物污染的卫生指标，是微生物检测的常规检测项目之一。常规菌落总数检测方法操作繁琐，需要准备试剂耗材较多。纸片法可以简化检测步骤、方便结果观察，并在食品菌落总数检测领域得到广泛的研究和应用。本文就纸片法检测水中菌落总数可行性进行研究。
1 资料与方法 1.1 检测材料恒温培养箱(LRH-250生化培养箱)；市售细菌总数检测纸片，编号(批号)分别为：纸片1(lop818711)、纸片2(2017052508)、纸片3(333W4X)；标准菌株：大肠埃希菌(Escherichia coli)ATCC 25922、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)ATCC 25923、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 27853；水样品：北京市内饮用水末梢水、中水、湖水。
1.2 方法 1.2.1 平皿计数法(简称国标法)检测方法参照《生活饮用水标准检验方法》(GB/T 5750.12-2006)[1]。
1.2.2 纸片法打开纸片覆盖膜，在纸片的中心滴加1 mL的水样，覆盖好纸片，等待几秒钟后，放入培养箱。36 ℃±1 ℃培养48 h。计数纸片上呈现的菌落数。同时加入灭菌生理盐水到另一张测试纸片上作为空白对照。
1.2.3 纸片法的重复性试验用营养肉汤复苏大肠埃希标准菌株、金黄色葡萄球标准菌株和铜绿假单胞菌标准菌株(37 ℃培养24 h)，分别从3种充分震荡后的复苏菌液中吸取1 mL菌液加入到27 mL生理盐水中，用生理盐水将上述稀释液以倍比稀释法，稀释成10 CFU/mL的菌悬液备用。用纸片法对4种不同类型的样品(配制的菌悬液、饮用水末梢水样品、中水样品和湖水样品)分别进行10次菌落总数重复性试验，以确定纸片法检测结果之间的一致程度。
1.2.4 比对试验分别用纸片法和国标法对人工配制水样和不同类型自然水样(饮用水末梢水、中水、湖水，共160份)，进行菌落总数的检测，获得784个检测结果，比较两种方法检测结果的一致性。
配制水样的制备将标准菌株大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别经复苏、倍比稀释，配制成10、100 CFU/mL的配制样品各6份，分别用纸片法和国标法进行菌落总数检测。
1.3 统计方法采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，采用秩和检验用于纸片法与国标法对水样中菌落总数检测结果的一致性比较分析，采用Pearson相关分析用于纸片法与国标法对不同类型水样菌落总数检测结果的相关性分析。P＜0.05表示具有统计学意义。
2 结果 2.1 纸片法重复性试验3种纸片对于不同类型水样的变异系数为：1.16%~4.97%(表 1)。
| 样品 | 纸片1 | 纸片2 | 纸片3 | ||||||||
| x | s | CV/% | x | s | CV/% | x | s | CV/% | |||
| 菌悬液 | 98.2 | 1.14 | 1.16 | 73.3 | 3.30 | 4.50 | 98.5 | 1.58 | 1.61 | ||
| 饮用水末梢水 | 17.7 | 0.82 | 4.65 | 15.1 | 0.74 | 4.89 | 23.6 | 1.17 | 4.97 | ||
| 中水 | 72.6 | 3.13 | 4.32 | 62.8 | 3.08 | 4.91 | 75.7 | 2.87 | 3.79 | ||
| 湖水 | 57.0 | 1.15 | 2.03 | 53.5 | 0.85 | 1.59 | 57.3 | 1.06 | 1.85 | ||
2.2 纸片法与国标法对配制水样菌落总数检测结果的比较
纸片1、纸片3的计数结果多于平皿计数法，差异有统计学意义(P＜0.05)；纸片2的计数结果少于平皿计数法，差异有统计学意义(P＜0.05)，结果见表 2和表 3。
| 菌株 | 国标法 | 纸片1 | 纸片2 | 纸片3 | |||||||||
| x±s/(CFU/mL) | x±s/(CFU/mL) | Z值 | P值 | x±s/(CFU/mL) | Z值 | P值 | x±s/(CFU/mL) | Z值 | P值 | ||||
| 大肠埃希菌 | 36.77±0.94 | 37.47±1.04 | -2.335 | 0.020 | 34.30±1.02 | -4.632 | ＜0.001 | 37.63±1.19 | -2.414 | 0.016 | |||
| 金黄色葡萄球菌 | 45.80±1.16 | 46.70±1.86 | -2.121 | 0.034 | 42.20±0.85 | -4.807 | ＜0.001 | 46.77±1.36 | -3.257 | 0.001 | |||
| 铜绿假单胞菌 | 53.37±1.10 | 54.43±1.07 | -3.281 | 0.001 | 51.70±1.32 | -4.106 | ＜0.001 | 55.67±1.03 | -4.501 | ＜0.001 | |||
| 注：3种纸片法分别与国标法比较，P＜0.05，n=30 | |||||||||||||
| 菌株 | 国标法 | 纸片1 | 纸片2 | 纸片3 | |||||||||
| x±s/(CFU/mL) | x±s/(CFU/mL) | Z值 | P值 | x±s/(CFU/mL) | Z值 | P值 | x±s/(CFU/mL) | Z值 | P值 | ||||
| 大肠埃希氏菌 | 102.93±0.87 | 103.70±1.02 | -2.570 | 0.010 | 101.60±1.22 | -3.627 | ＜0.001 | 103.80±0.85 | -3.259 | 0.001 | |||
| 金黄色葡萄球菌 | 107.00±1.11 | 108.00±1.20 | -3.085 | 0.002 | 103.07±1.41 | -4.819 | ＜0.001 | 108.20±1.00 | -3.517 | ＜0.001 | |||
| 铜绿假单胞菌 | 123.13±1.20 | 124.33±1.06 | -3.480 | 0.001 | 122.23±1.07 | -2.524 | 0.012 | 124.87±0.97 | -3.906 | ＜0.001 | |||
| 注：3种纸片法分别与国标法比较，P＜0.05，n=30 | |||||||||||||
2.3 纸片法与国标法对不同类型自然水样菌落总数检测结果的比较
纸片法与国标法对124份不同类型的水样(饮用水末梢水20份、中水52份、湖水52份)的菌落总数检测结果，差异有统计学意义(P＜0.001)，纸片1、纸片3检测结果高于国标法；纸片2检测结果低于国标法，但经Pearson相关分析得到，纸片法的检测结果与国标法呈正相关(r1=0.925;r2=0.840;r3=0.824，P＜0.001；图 1)。
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| 图 1 纸片法对不同类型自然水样菌落总数检测结果与国标方法线性关系 |
3 讨论
通过本研究对菌落总数纸片法的重复性试验及与国标法对不同类型水质检测结果的比较，可以得到纸片法的变异系数为：1.16%~4.97%，说明纸片法检测结果间的一致性较好(变异系数小于5%)[2]。通过相关分析，得到纸片法菌落总数检测结果与国标法检测结果呈正相关[3-6](r>0.824, P＜0.001)，即纸片法的检测结果和国标法的检测结果之间存在密切的相关性。因此纸片法可用于水质检测菌落总数污染的趋势监测、污染事故和应急卫生保障等工作中菌落总数污染的筛查方法以及紧急情况下的现场检测等。
通过对比试验发现纸片1、纸片3菌落总数检测结果高于国标法[7-8]；而纸片2的菌落总数检测结果低于国标法，推测可能是由于3种纸片的吸水性和扩散性各不相同，即不同纸片的加工工艺和材质各不相同所致。此影响因素尚需进一步的研究。提示在选择纸片的时候，一定要进行预实验，选择灵敏度高的纸片，以防漏检。而对于灵敏度高的纸片在评判时，可能会出现不合格率高的情况，如何修正纸片法的检测结果进而完成评判工作，还需要通过增加样本量、样本类型进行修正系数确定方面的进一步研究。
纸片法的检测原理是将细菌生长所需营养成分和着色剂固定在纸片上，当有细菌存在的情况下，在其适合的生长条件下，即可在纸片上形成菌落并产生显色反应。较之国标法纸片法无需配制灭菌培养基；显色反应也易于观察[9]；检测步骤简单，只需1 min即可完成[10]；检测环境要求不高，纸片体积小可节省培养箱的使用空间；大大提高工作的有效率及工作质量[11]。
综上所述，由于纸片法检测结果与国标法有相关性，且操作简单、适合现场检测等特点，故可用于水质菌落总数污染的趋势监测、污染事故和应急卫生保障等工作中菌落总数污染的筛查方法以及紧急情况下的现场检测等。虽然目前菌落总数纸片法常被应用在食品检测中，在水质检测方面没有得到开发及应用，但通过本文对纸片法的分析认为纸片法在水质菌落总数检测方面具有推广应用价值[12]。
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