军团菌(Legionella)是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阴性菌^[1-2]。作为机会性致病菌，能引起以肺部感染为主，可能合并肺外其他系统损害的感染性疾病^[3]。在报告病例中，死亡率高达10%~15%。在人工水域、天然淡水、土壤和通风系统等环境中常能检测到军团菌，特别是在集中空调的循环水系统中, 检出率更高^[4]。酒店和医院等公共场所由于人群密集，流动性大，是军团菌病的易发场所。我国个别省市已经开展了公共场所中军团菌污染状况的调查^[5-7]，但总体上该类调查偏少。本人以江苏省南京市内的医院、商场及酒店为研究对象，开展了这些场所中水和土壤样品中军团菌检出率的调查，为江苏省军团菌污染状况提供数据支持。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂

台式冷冻高速离心机(Eppendorf，德国)，CO₂恒温培养箱(NAPCO2IN 5420-1)，德国浓缩仪器Minicon B15(默克密理博公司)，自动集菌器(Millpore EZ-Par)，全自动核酸提取仪(台湾台塑，MeDiProSuperPure System-32 D32035)，ABI 7500型荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)，Biosample液体撞击采样器(SKC公司，美国), 军团菌BCYE基础培养基，军团菌GVPC选择培养基，军团菌与嗜肺军团菌荧光PCR(上海之江工程有限公司)，Probe RealMaster Mix定量PCR反应系统(北京天根)，全自动DNA/RNA核酸双提提取试剂盒(台湾台塑公司)，嗜肺军团菌标准菌株ATCC 33152(江苏出入境检验检疫局)。

1.1.2 样品采集 1.1.2.1 水样

水样用无菌袋采集，每份500 ml，24 h内送检。采集水样的场所为酒店、商场和医院。水源包括公共场所的公用自来水、内外部景观水、室内淋浴水和空调冷却水。水样品共130份，其中酒店、医院各50份，商场30份。水样品冷却水、景观水、自来水每个单位各10份，淋浴水各20份，商场未采集淋浴水。

1.1.2.2 土壤

用高压灭菌处理的钢勺和小毛刷采集场所采集内空调风管积尘土和背景土，每份2 g以上。采集景观土(景观区域深度10 cm以上深度的土壤)和花卉土(盆栽花卉的表层土)，每份10 g以上。采集后的样本分别置于50 mL离心管内，送实验室检测。土壤样品共120份，其中医院、商场及酒店各40份。每40份样品包括背景土、花卉土、风管积尘土和景观土各10份。

1.1.2.3 空气样品的采集

用Biosampler采样器采集气溶胶样品，采样参数：流速：12.5 L/min，时间30 min, 采集液20 mL纯净水。气溶胶样品共300份，酒店、医院和商场各100份。其中每个单位包括冷却塔内、外样品各20份，房间内空调与走廊空调样品各30份。

1.2 方法

1.2.1 样品处理 1.2.1.1 水样

采用无菌操作将水样通过膜过滤系统，采用孔径0.45 μm的滤膜过滤。过滤完毕后用无菌镊子取下滤膜放在事先加入15 mL无菌蒸馏水和少量灭菌玻璃株的灭菌锥形瓶中，将锥形瓶置于振荡器上充分振荡洗脱。

1.2.1.2 土壤样品

① 花卉土、背景土和景观土。将无菌采集到的公共场所花卉土、背景土和景观土进行充分洗脱，样本充分均匀后每份样品称取5 g，无菌操作将样品置于预先灭菌并装有适量无菌玻璃珠的锥形瓶里，并加入0.2 M PBS 45 mL，内含0.01%吐温80，置于自动振荡器于(200~300) r/min，震荡(30~40) min，随后静置20 min。②空调风管内积尘样品。采集样品后，先进行洗脱分离，首先将样品充分混合，从中称取0.5 g，采用无菌操作置于事先灭菌并装有适量无菌玻璃珠的容量为30 mL小锥形瓶中，加入0.2 M PBS 4.5 mL，其中含有0.01%吐温80，在振荡器上震荡(20~30) min，速度为(200~300) r/min，然后静置20 min。

1.2.1.3 空气样品

直接进行培养和PCR实验。

1.2.2 军团菌分离、培养及鉴定

将采集到的样品分别进行热处理和酸处理。然后将未处理、热处理和酸处理后的标本各取0.2 mL，接种在GVPC选择性培养平板上，置37 ℃，CO₂恒温培养箱(CO₂浓度为5%)培养，防止干燥，每天观察细菌生长情况，在48 h内生长出的菌落是非军团菌，(48~72) h长出的是可疑军团菌，将72 h后生长出的菌落进行标记计数并进行下一步的鉴定。

从GVPC平板中挑取可疑菌落先进行革兰染色，并将可疑菌落接种在BCYE和血平板上，37℃培养48 h。在BCYE平板生长而在血平板上不生长的菌落，可初步认定是军团菌，将初步鉴定为军团菌的菌株进行生化试验和血清凝集分型。

1.2.3 PCR检测嗜肺军团菌

阳性对照标准菌株：嗜肺军团菌ATCC 33152，阴性对照标准菌株：金黄色葡萄球菌ATCC 6538，以嗜肺军团特有的Mip基因进行引物设计。上游引物为GAAAATAAAGTAAAAGGGGAAGCC(LP-F)，下游引物为ATCAATCAGACGACCAGTGTATTC(LP-R), 荧光探针为：FAM-AGGCGTTGTTGTATTGCCAAG TGGTT-TAMRA(LP-P)。探针和标准品为上海闪晶分子生物科技有限公司合成。配制标准品，母液浓度是2.93×10⁹ copies/μL，将标准品依次稀释为2.93×10⁹、2.93×10⁸、2.93×10⁷、2.93×10⁶、2.93×10⁵、2.93×10⁴、2.93×10³、2.93×10²和2.93×10 copies/μL的9个浓度梯度进行扩增，制作标准曲线。

PCR的反应体系为25 μL，主反应液10 μL，引物0.5 μL，探针0.25 μL，荧光探针增加液1.25 μL，模板2 μL，无核酸酶去离子水10.5 μL。扩增条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性，20 s，60 ℃ 60 s，共40个循环。空白对照中模板用去离子水替代。

1.2.4 统计分析

不同样品间军团菌检出率的差异用OpenEpi在线软件2.3.1版本(http://www.openepi.com/OE2.3/Menu/OpenEpiMenu.htm)进行卡方检验。

1.2.5 质量控制

所用试剂均在有效期内使用，细菌培养其在检测前用标准菌株进行验收，核酸检测中设置了阴阳性对照，培养法检测时用设置了阴性和标准株的对照。

2 结果 2.1 水样品军团菌检测结果

医院、商场和酒店中分别采集冷却水、景观水和自来水各30份，淋浴水40份，共130份。检测结果见表 1所示：应用培养法从冷却水和淋浴水中检测到军团菌，其它样品中均未检测到。应用PCR法在冷却水、淋浴水、自来水中均检测到军团菌。冷却水中军团菌的检出率最高，检出率为100%，其次为淋浴水和自来水，检出率分别为12.5%和3.3%。不同类型的样品中军团菌的检出存在显著性差异(P < 0.001)。

2.2 土壤类样品军团菌检测结果

土壤样品共120份，其中医院、商场和酒店各40份。每40份样品包括背景土、花卉土、风管积尘土、景观土各10份。经传统培养法和荧光定量PCR法检测之后，培养法均未检出军团菌。PCR法在酒店背景土、酒店风管积尘土以及商场风管积尘土各检出1份阳性，检出率仅为10%。

2.3 气溶胶样品军团菌检测

医院、商场和酒店中采集的气溶胶样品(冷却塔内外、房间内空调出风口、走廊通道空调出风口)共300份运用传统培养法从冷却塔内采集的2份空气样品中检测到军团菌，检出率为1.7%.荧光定量PCR法检测结果如表 2所示。房间内空调空气样品的军团菌的检测出率最高，达到32.4%；其次为冷却塔内空气样品，检测出率为26.7%。不同区域采集的样品，军团菌的检出率存在显著性差异(χ²=11.79，P < 0.01)。

2.4 南京市公共场所军团菌血清分型结果

对从公共场所检出的34份军团菌进行了血清分型，血清型包括LP1、LP6、Lb。分型结果如表 3所示：34株军团菌中只有27株能够明确定型，占79.4%。在定型的菌株中，三种血清型的分布比例相近，未发现明显的优势血清型存在。

3 讨论

近年来我国部分省市报道了公共场所环境中军团菌的污染状况，不论是公共场所的空气或是水源、集中空调系统中均存在军团菌污染，只是各地区程度不同^[8-13]。本次调查发现公共场所的冷却水中的军团菌阳性率最高，PCR的检出率达100%，培养法的检出率也接近100%。就空调冷却水中的军团菌检出率来说，本次调查中发现的检出率比国外报道的公共场所中空调冷却水中军团菌中的检出率(42%~49%)高^[14]。但由于采样数量较少，关于不同国家和地区公共场所中军团菌中的差异还需要更深入的调查研究。军团菌的检出率存在季节性，夏季检出率普遍高于秋季，尤其是培养法。秋季菌株分离率低，主要是因为军团菌在寒冷的气候下存活率低或者生长缓慢，但是不同季节军团菌PCR的分离率都比较接近，提示公共场所空调水中军团菌的污染状况是比较普遍的。

本次调查首次从公共场所的淋浴水中分离出了军团菌株。这可能是因为供水系统管道污染了军团菌。虽然淋浴水不是饮用水，但是淋浴时产生的气溶胶也会通过呼吸道进入人体肺部。所以淋浴水军团菌检出阳性会使人有感染军团菌的风险。尤其是医院里免疫力低下的病人，感染风险更高。但具体淋浴水造成院内感染的几率有待进一步的研究。虽然本次调查没有从土壤样品均未分离出军团菌菌株，但是120份土壤样品中有2份PCR检出阳性。提示公共场所中土壤仍然存在被空调冷却水等污染的可能性。本次调查共采集了300份公共场所的气溶胶样品，有两份冷却塔内气溶胶样品分离出了军团菌株，检出率为0.7%。但是PCR的阳性率在6.7%~33.3%之间，覆盖了冷却塔内外和房间、走廊环境中的气溶胶样品。这提示在公共场所中，军团菌分布的广泛性。虽然我国公共场所的不同环境中均存在不同程度的军团菌的污染，但是目前尚不能建立公共场所中流行的军团菌与军团菌肺炎病人间的关系。尽管如此，降低公共场所中军团菌的流行势在必行。建议不仅从业人员在开展相关工作时要做好防护，而且公共场所要定期做好相应的消毒工作。