氯乙烯(Vinyl Chloride)又名乙烯基氯，无色、易液化气体，氯乙烯主要通过呼吸道和皮肤进入人体，可以对人体多个器官和系统产生毒性[1-2]。国际癌症研究机构(IARC)在1987年把氯乙烯列为1类致癌物。我国《工作场所有害因素职业接触限值》[3]规定氯乙烯时间加权平均容许浓度(PC-TWA)为：10 mg/m3。高剂量接触氯乙烯进入体内，可以通过肝微粒体细胞色素P450酶(主要是Cytochrome P450 2E1，CYP2E1)代谢转化形成中间产物氯乙烯环氧化物(Chloroethylene oxide，CEO)，CEO经过分子重排形成氯乙醛(Chloroacetaldehyde，CAA)，脱氧核糖核酸(Deoxyri-bonucleic acid, DNA)可以与氯乙烯环氧化物(Chloroethylene oxide，CEO)和氯乙醛(Chloroacetaldehyde，CAA)这类物质发生烷化反应，形成多种DNA加合物，导致DNA损伤，甚至造成DNA链的断裂，驱动正常细胞癌变，最终导致肿瘤的发生[4-5]。
氯乙烯导致的亚乙烯基DNA加合物常见的有两种，1, N6-亚乙烯基-2’-脱氧腺苷(εdA)和3, N4-亚乙烯基-2’-脱氧胞苷(εdC)。这两种DNA加合物半衰期长、稳定性好、在DNA复制过程中修复率低，具有较强的致突变能力，可作为氯乙烯暴露致DNA损伤的效应指标。
本文通过检测氯乙烯暴露组和对照组血样中εdA、εdC两种DNA加合物的含量，并进行单因素方差分析和多因素方差分析，评估低剂量氯乙烯职业接触人群的DNA损伤情况，为氯乙烯的职业接触对健康的危害提供参考。
1 对象与方法 1.1 研究对象本研究选取的氯乙烯现场为山东某氯乙烯生产企业，企业定期开展工作场所空气有害物质的日常监测。查阅该厂2014—2016年的氯乙烯日常监测资料发现氯乙烯和聚氯乙烯车间内氯乙烯的外暴露浓度(PC-TWA)为：(0.1~0.4) mg/m3，对照组外暴露浓度 < 1.6×10-3 mg/m3(氯乙烯检出限)，均低于工作场所氯乙烯时间加权平均容许浓度(PC-TWA)：10 mg/m3。暴露组共34人，为该企业氯乙烯和聚氯乙烯车间的操作工人，工龄均超过1 a。对照组共10人，为该企业后勤人员和行政人员(工作岗位不接触氯乙烯)。暴露组与对照组均无尿烷与苯系物接触史。
1.2 试剂和仪器 1.2.1 试剂乙腈、甲醇(色谱纯，Thermo Fisher)；乙醇(色谱纯，Sigma-Aldrich)；Tris、氯化钙(分析纯，Sigma-Aldrich)；磷酸二酯酶、微球菌核酸酶、核酸酶P1、脱氧腺苷dA、脱氧胞苷dC、[15N5]-dA、[15N3]-dC(Sigma-Aldrich，美国)；屈臣氏蒸馏水。pH=6.8的Tris缓冲液；0.025 units/μL的外切酶SPD；0.2 units/μL的内切酶Micrococcal Nuclease；εdA、εdC、[15N5]-εdA、[15N3]-εdC标准品由实验室合成并用HPLC提纯，依据Beer-Lambert Law：A=εbc(A为吸光度；ε为摩尔吸光系数；b为光程；c为物质浓度)定量。定量后的标准品-80℃保存。
1.2.2 仪器电子天平(感量：0.01 mg，赛多利斯BS210S，德国)；涡旋振荡器(SBP，美国)；高速离心机(Sigma，3K15，美国)；真空浓缩仪(艾本德，德国)；恒温水浴摇床(上海晶坛仪器制造有限公司)；紫外可见分光光度计(Thermo Fisher GENESYS 10S，美国)；高效液相色谱仪器(Waters 2690/996，美国)；超高效液相色谱串联质谱(Waters I-class/AB5500质谱，美国)；DNA提取试剂盒(QIAGEN，德国)；色谱柱(Waters BEH C18 1.7 μm 2.1×50 mm，美国)；超滤管(Millipore，50k，德国)。
1.3 方法 1.3.1 样品采集及保存利用EDTA抗凝的真空采血管采集研究对象4 mL静脉血全血，并于-80℃冰箱内存储。采集血样已获得研究对象知情同意。
1.3.2 样品处理本实验采用DNA提取试剂盒提取研究对象血样中的DNA，按试剂盒操作说明进行提前操作[6]。并利用紫外可见分光光度计对提取的DNA进行定量，利用Micrococcal nuclease、Spleen phosphodiesterase和NucleaseP1 3种酶对DNA进行水解，DNA被酶最终水解为单个核苷，水解液中含有大量的正常核苷、酶及少量的被修饰的核苷，水解液采用高效液相色谱进行纯化，通过εdA, εdC标准品的保留时间定性，之后用离心管收集目标化合物εdA, εdC，真空浓缩仪浓缩干燥，最后复溶在50 μL蒸馏水中。
1.3.3 样品测定用50 μL去离子水复溶处理好的血液样品，用超高效液相色谱串联质谱进行检测εdA和εdC含量。以同位素标记的[15N5]-εdA、[15N3]-εdC作为内标进行定量。超高效液相色谱柱温35℃，进样体积5 μL；质谱采用电喷雾电离正离子模式，定量方法采用多反应离子监测模式。具体参数见表 1和表 2。
| 时间/min | 流速/(mL/度曲线) | A甲醇/% | B水/% |
| 0 | 0.25 | 5 | 95 |
| 6 | 0.25 | 7 | 93 |
| 9 | 0.25 | 7 | 93 |
| 10 | 0.25 | 99 | 1 |
| 12 | 0.25 | 99 | 1 |
| 13 | 0.25 | 5 | 95 |
| 15 | 0.25 | 5 | 95 |
| 化合物名称 | 母离子 | 定量子离子 | EP | DP | CXP |
| εdC | 252 | 136 | 10 | 50 | 17 |
| [15N3]-εdC | 255 | 139 | 10 | 50 | 17 |
| εdA | 276 | 160 | 12 | 51 | 18 |
| [15N5]-εdA | 281 | 165 | 12 | 51 | 18 |
1.3.4 标准曲线的制备
准确量取εdA、εdC标准品10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0 pg加入6份1 mL的流动相中，分别加入500 pg[15N5]-εdA和500 pg[15N3]-εdC作为内标。利用上述仪器条件进行检测，以εdA和εdC的峰面积与[15N5]-εdA和[15N3]-εdC峰面积的比值同分析物εdA和εdC的质量(pg)计算εdA、εdC的线性回归方程，分别为y=0.001 9x+0.003 8，r2=0.999 9；y=0.002 2x+0.004 3，r2=0.999 8。
1.4 质量控制本实验方法，利用同位素标记的[15N5]-εdA和[15N3]-εdC作为内标进行质量控制，在DNA酶解过程中加入内标，保证样品检测结果的准确度和重复性。
εdA和εdC以及同位素标记的[15N5]-εdA和[15N3]-εdC没有商品化的标准品，本实验室采用脱氧核苷dA、dC；同位素标记的脱氧核苷[15N5]-dA、[15N3]-dC与氯乙醛反应制得。详细的制备过程在以往的研究中有详细叙述[7]。
1.5 统计学分析检测数据采用SPSS 19.0进行统计分析。应用单因素方差和多因素方差分析性别、年龄、饮酒、吸烟、氯乙烯暴露情况等因素对εdA和εdC含量的影响，检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 样品基本情况本次研究共选取研究对象44人，暴露组34人，对照组10人。其中男性36人，女性8人，年龄均在(27~55)周岁之间(中位数45周岁)。研究对象的一般情况如表 3所示。
| 分组 | 性别 | ≥45岁 | < 45岁 | 吸烟 | 不吸烟 | 饮酒 | 不饮酒 | 合计 |
| 暴露组 | 男 | 13 | 13 | 16 | 10 | 11 | 15 | 26 |
| 女 | 5 | 3 | 0 | 8 | 0 | 8 | 8 | |
| 对照组 | 男 | 5 | 5 | 5 | 5 | 3 | 7 | 10 |
| 女 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 合计 | 23 | 21 | 21 | 23 | 14 | 30 | 44 |
2.2 样品中εdA和εdC统计分析结果 2.2.1 单因素方差分析
暴露组εdA和εdC的检测结果范围：(0~14.94) pmol/mg、(0.22~9.29) pmol/mg；对照组εdA和εdC的检测结果范围：(0.13~4.33) pmol/mg和(0~2.34) pmol/mg。以暴露对照、年龄、吸烟与否和饮酒与否为影响因素进行方差分析，结果显示，εdA和εdC在暴露组血液中的含量明显高于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)；以年龄和吸烟与否进行分组，εdA和εdC含量差异无统计学意义(P > 0.05)；以饮酒与否进行分组，饮酒者血液中εdC含量高于非饮酒者，差异有统计学意义(P < 0.05)；εdA含量差异无统计学意义(P > 0.05;表 4)。
| 样品数/n | εdA/(pmol/mg) | εdC/(pmol/mg) | |
| 暴露组 | 34 | 3.03±2.38 | 2.06±1.75 |
| 对照组 | 10 | 1.39±1.20 | 0.83±0.73 |
| P值 | - | 0.026 | 0.015 |
| < 45岁 | 21 | 2.23±1.22 | 1.71±1.89 |
| ≥45岁 | 23 | 3.04±2.89 | 1.84±1.45 |
| P值 | - | 0.241 | 0.789 |
| 吸烟 | 21 | 3.17±2.94 | 2.15±2.08 |
| 不吸烟 | 23 | 2.19±1.30 | 1.44±1.08 |
| P值 | - | 0.154 | 0.156 |
| 饮酒 | 14 | 3.48±3.58 | 2.65±2.44 |
| 不饮酒 | 30 | 2.27±1.18 | 1.37±0.92 |
| P值 | - | 0.098 | 0.015 |
| 注：“-”为无数值 | |||
2.2.2 多因素方差分析
分别以暴露对照、年龄、吸烟与否、饮酒与否为自变量，血液中εdA、εdC含量为因变量进行多因素方差分析。结果显示，氯乙烯暴露浓度(0.1~0.4) mg/m3，也可导致接触者血液中εdA和εdC含量升高，差异有统计学意义，P < 0.05。年龄、吸烟、饮酒对接触者血液中εdA和εdC含量的影响差异无统计学意义(P > 0.05;表 5)。
| 影响因素 | εdA | εdC | |||||
| 均方 | F值 | P值 | 均方 | F值 | P值 | ||
| 暴露分组 | 24.14 | 5.10 | 0.031 | 12.29 | 4.75 | 0.037 | |
| 吸烟 | 1.46 | 0.31 | 0.583 | 1.47 | 0.57 | 0.46 | |
| 饮酒 | 0.49 | 0.10 | 0.751 | 1.36 | 0.53 | 0.53 | |
| 年龄 | 7.75 | 1.64 | 0.211 | 0.92 | 0.36 | 0.36 | |
2.2.3 εdA、εdC含量的相关性分析
44名研究对象εdA和εdC含量范围：(0~14.94)pmol/mg、(0~9.29) pmol/mg。以Spearman相关分析法对εdA、εdC含量的相关性进行分析，回归方程为：y=1.39+0.711x，相关系数为0.498，0.01水平上显著相关(P < 0.05)。
εdA与εdC是脱氧腺苷(dA)和脱氧胞苷(dC)与氯乙烯代谢产物氯乙醛(CAA)反应的产物。dA和dC在体内普遍存在，参与DNA的复制，其碱基都容易与亲核基团(如CAA)进行反应。这可能是εdA与εdC显著相关的原因。但dA和dC的分子结构不同，与亲核基团(如CAA)的反应能力略有差异，并且所产生的εdA与εdC被DNA修复酶修复的概率不同，从而导致εdA与εdC在体内的含量有差异。饮酒者血液中εdC含量高于非饮酒者，差异有统计学意义(P > 0.05)，可能是由于酒精会影响εdC修复酶的活性，使εdC被修复的概率降低。因此，在研究εdC加合物时，应考虑饮酒对其含量的影响。
3 讨论 3.1 DNA加合物的选择当人体接触氯乙烯和尿烷这类物质时，氯乙烯在体内代谢产生活性中间体氯乙烯环氧化物(CEO)和氯乙醛(CAA)，可以与DNA分子结合从而形成Etheno-DNA加合物造成DNA损伤[8-9]。当DNA损伤超过人体自身修复能力时，DNA加合物就会保留在DNA链上进入复制过程，导致致癌因子的启动，从而诱发癌症[10-11]。εdA和εdC这两种加合物稳定性好，半衰期长，可以作为接触标志物反映毒物在靶部位的效应剂量，又可以作为效应标志物反映DNA的损伤程度。因此Etheno-DNA加合物在DNA损伤及相关外源性化合物毒性研究中具有重要意义。
3.2 氯乙烯的代谢及DNA损伤分析氯乙烯在空气中以蒸汽态存在，人体吸入氯乙烯后，大部分随呼吸经肺排出体外，进入体内的氯乙烯根据外暴露浓度的高低分为两种代谢途径[12-13]。当氯乙烯外暴露浓度高于25.9 mg/m3，在肝微粒体细胞色素P450酶(CYP2E1)的作用下，氯乙烯被氧化形成氯乙烯环氧化物(CEO)，其中一部分CEO在谷胱甘肽转移酶(GST)的作用下失去活性[14]。另一部分CEO经分子重排形成氯乙醛(CAA)。CEO和CAA反应活性强，可以与DNA等大分子发生烷化反应，形成DNA加合物[15]。
本研究结果显示，低剂量的氯乙烯暴露(< 10 mg/m3)情况下，暴露组工人血液中εdA、εdC的含量普遍高于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)，表明低剂量的氯乙烯进入人体内，也生成了活性中间体氯乙烯环氧化物(CEO)和氯乙醛(CAA)并进一步与DNA反应，生成DNA加合物。所以即使低剂量氯乙烯暴露也存在致DNA损伤导致肿瘤的风险。
单因素方差分析中，年龄和吸烟对人体血液中εdA及εdC含量影响差异无统计学意义(P > 0.05)；饮酒对人体血液中εdA含量影响差异无统计学意义(P > 0.05)；饮酒者血液中εdC含量高于非饮酒者，差异有统计学意义(P < 0.05)，然而多因素分析中，饮酒与否对血液中εdC含量影响差异无统计学意义。需做进一步研究来确定饮酒对血液中εdC含量的影响。
人体中DNA碱基修复酶活性会随着年龄的增长而降低，DNA损伤的修复能力也会下降，然而本次研究年龄大于45岁组和小于45岁组血液中两种DNA加合物含量差异无统计学意义。这可能与本次研究氯乙烯暴露剂量较低，两个年龄组的工人对εdA、εdC两种加合物的修复能力无差异。
综上，分析氯乙烯职业暴露者血液中εdA、εdC两种DNA加合物的含量，发现即使氯乙烯职业暴露水平均低于我国职业接触限值的剂量水平时，暴露组的εdA和εdC含量明显高于对照组的水平，且εdA与εdC含量之间存在显著性正相关。提示我国氯乙烯的职业接触限值的合理性和安全性应进一步评估，为保护工人劳动者的安全做出合理的调整。
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