2. 芜湖市疾病预防控制中心
水体富营养化引起蓝藻水华产生微囊藻毒素(microcystins，MCs)。体内外实验及流行病学调查表明微囊藻毒素-LR(MC-LR)具有肝毒性及致癌性。饮水氯化消毒易使胞壁破裂释放出水溶性的MCs[1]，常规饮水工艺很难有效清除，且MCs具有化学稳定性和耐热性，加热煮沸也很难灭活。MCs经饮水途径暴露具有普遍性、低剂量和长期性，饮水途径MCs暴露是一个全球性的健康问题。MCs的肝毒性和肿瘤促进潜力已被广泛研究并有大量文献报道，然而有证据表明MCs能损害人类的正常免疫机制，可能与一些疾病存在关联(包括癌症风险增加)，但目前对其免疫毒性研究的文献则相对不多。本文回顾过去MCs免疫毒性的试验研究，综合免疫毒性的重要信息，讨论当前相关认知和研究需求，以利于MCs饮水暴露与免疫相关疾病之间的潜在关系及机制的进一步调查研究，为环境卫生研究与管理工作者提供一定的帮助与参考。
1 微囊藻毒素简介MCs是伴随蓝藻水华产生的由7个氨基酸组成的单环七肽化合物，分子量800~1100，结构通式为环D-丙氨酸-L-X-赤-β-甲基-D-异天冬氨酸-L-Z-Adda-D-异谷氨酸-N-甲基脱氢丙氨酸。微囊藻、节球藻、鱼腥藻等蓝藻的产毒株均可产生MCs[2]。MCs基于氨基酸的组成和肽环不同位点的甲基化或反甲基化异构为同系物，迄今文献描述的MCs同系物已有约100种[3]，自然条件下通常以几种异构体的混合物形式存在，MC-LR、MC-YR、MC-RR较常见，MC-LR毒性最大，通常是主要毒性成份。
营养物浓度、光照强度、pH、浊度、水温、湍流、盐度、竞争性细菌和浮游植物等环境条件因素都能影响蓝藻生长和种群动态变化。细胞外的MCs约占其水中总量的30%[4]。MCs通常保持在蓝藻细胞内，当胞壁破坏或细胞死亡时释放。MCs具有高水溶性和化学稳定性，不易挥发，耐酸碱变化，水解缓慢，即使煮沸15 min后仍有很强毒性。自然降解通常需要21天—3个月，水华频繁出现时可迅速发生累积，危及饮水安全。调查显示，我国MCs污染呈明显的季节性差异，部分南方城市丰水期出厂水可检出低浓度的MC-LR，最高浓度多出现在10月份，最高为1.27 μg/L(上海，2003年10月)，2009年7月—2010年9月苏州、湖州、无锡的出厂水MC-LR平均浓度约为水源水的60%，常规水处理工艺不能有效地去除[5]，人群经饮水途径长期低浓度暴露于MCs中。
MCs经口途径进入人体主要通过小肠(部分通过胃)吸收，经门静脉进入肝脏，可穿过血脑屏障进入大脑。MCs无法直接渗透细胞的脂质膜，需通过有机阴离子转运多肽(OATP)的跨膜转运进入细胞[6]，在体内与半胱氨酸和谷胱甘肽结合能增加其溶解度并促进其胆汁排泄[7]。流行病学调查显示，MCs长期暴露与人类疾病之间存在关联，如腹泻、胃肠道疾病、肝功能损伤、肾功能损伤、肝癌、不良妊娠结局以及死亡等[8-9]。结合大量的体内体外试验证据表明，MCs对人类具有以肝脏为主要靶器官的肝毒性及致癌性，同时还有肾毒性[10]、生殖毒性[11]、神经毒性[12]和免疫毒性。2010年国际癌症研究机构(IARC)将MC-LR列为可能的人类致癌物(2B组)[13]。2011年世界卫生组织(WHO)的饮用水水质准则将MC-LR(游离态与细胞结合态之和)的暂行准则值定为1 μg/L，每日可耐受摄入量(TDI)定为0.04 μg/(kg ·bw)[14]。
2 免疫毒性效应早期研究人员选择对脂多糖不敏感的小鼠腹膜内注射蓝藻提取物，2周后再皮下注射观察到足跖肿胀的迟发型超敏反应[15]。此后的体内体外试验[16]先后观察到MCs作为免疫入侵者引起的多种免疫毒性效应(表 1)。
| 试验方法 | 年份 | 剂量 | 免疫相关效应 | 文献 |
| 对红细胞的影响 | ||||
| 大鼠腹腔注射试验 | 1995 | MC-LR(200 μg/kg) | 红细胞计数，血红蛋白浓度、红细胞压积呈剂量依赖性降低 | [18] |
| 人红细胞体外培养试验 | 2006 | MC-LR(1 nmol/L~1000 nmol/L) | 膜的脂质过氧化(1 nmol/L~)；形成棘形红细胞，降低谷胱甘肽还原酶和超氧化物歧化酶活性，提高过氧化氢酶活性，血红蛋白转化为高铁血红蛋白，降低细胞膜流动性(10 nmol/L~)；降低过氧化氢酶活性，形成ROS，溶血(100 nmol/L~) | [19] |
| 饲喂小鼠试验(28 d) | 2013 | 蓝藻提取物(MCs: 136μg/kg~3 000 μg/kg) | RBC、MCV降低，MCH、MCHC增加 | [20] |
| 对中性粒细胞和巨噬细胞的影响 | ||||
| 人类细胞体外培养试验 | 2000 | MC-LR(0.01 nmol/L~1 nmol/L) | 1 nmol/L显著增强多形核白细胞的早期黏附 | [21] |
| 小鼠腹腔注射试验(14 d) | 2003 | 蓝藻提取物(MCs:16mg/kg, 32 mg/kg，64mg/kg) | 腹腔巨噬细胞吞噬指数降低，而对吞噬百分率的影响不明显 | [22] |
| 小鼠巨噬细胞体外培养试验 | 2005 | MC-LR(1 nmol/L, 10nmol/L, 100 nmol/L, 1000 nmol/L) | iNOS、IL-1β、TNF-α、GM-CSF、IFN-γ的mRNA表达比仅LPS暴露的对照组显著下降(1 nmol/L~：iNOS，IL-1β，TNF-α；10 nmol/L~：GM-CSF，IFN-γ) | [23] |
| 人和大鼠中性粒细胞体外培养试验 | 2008 | MC-LR, MC-YR, MC-LA(1 nmol/L, 1000 nmol/L) | IL-8和ROS水平增加，增加细胞内钙水平诱导中性粒细胞趋化 | [24, 25] |
| 兔白细胞动力学研究 | 2010 | MC-LR(50 μg/kg、12.5 μg/kg) | 高剂量组诱导外周血WBC增加，IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-3和IL-6生成减少；低剂量组WBC、IFN-α、IFN-γ、IL-4、IL-3、IL-6生成逐渐增加，12 h达高峰，24 h后下降；细胞因子的产生在IL-4和IL-6，IFN-α和IFN-γ，IL-4和IFN-γ之间分别呈正相关关系 | [26] |
| 小鼠巨噬细胞体外试验 | 2015 | MC-LR(1 nmol/L~1000 nmol/L) | 蛋白磷酸化酶(PP1和PP2A)未受抑制，TNF-α水平提高，并诱发巨噬细胞激活NF-kB和ERK1/2 | [27] |
| 对淋巴细胞的影响 | ||||
| 小鼠腹腔注射试验 | 2003 | MCs(16 nmol/L, 32 nmol/L，64 mg/kg) | 脂多糖诱导的淋巴细胞增殖受抑制，抗体生成细胞数量呈剂量依赖性减少 | [22] |
| 人类外周血淋巴细胞培养试验 | 2004 | MC-LR(1 nmol/L, 10 nmol/L，25 μg/mL) | B细胞增殖受到抑制，仅在高浓度T细胞增殖减少；彗星试验显示抑制辐射损伤修复 | [28, 29] |
| 小鼠腹腔注射试验 | 2004 | 蓝藻提取物(MCs:23 mg/kg, 38 mg/kg，77 mg/kg, 115 mg/kg) | TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-4的mRNA表达水平下降，IL-6不受影响 | [30] |
| 小鼠淋巴细胞培养试验 | 2005 | MC-LR(7.5 μg/mL) | 诱导B细胞凋亡，T细胞不受影响 | [31] |
| 人外周血淋巴细胞培养试验 | 2011 | MC-LR(0.1 μg/kg, 1 μg/kg, 10 μg/mL) | 诱导氧化应激间接损伤淋巴细胞DNA的损伤应答基因(p53，mdm2，gadd45a，cdkn1a)，损伤呈剂量时间依赖性增加，并改变人类抑癌基因p53的mRNA表达 | [32] |
| 饲喂小鼠试验(28 d) | 2013 | 蓝藻提取物(MCs: 136μg/kg~3000 μg/kg) | 外周血中NK细胞和γδ+T淋巴细胞显著增加 | [20] |
| 小鼠腹腔内注射 | 2013 | MC-LR(2 μg/kg，8 μg/kg) | 骨髓细胞微核频率显著升高，骨髓细胞增殖显著下降 | [33] |
| 对人类过敏反应的影响 | ||||
| 259名慢性鼻炎患者脱毒蓝藻试剂皮肤致敏研究 | 2011 | 86%的临床受试者SPT阳性，过敏性鼻炎患者比对照组(非过敏性健康受试者)对蓝藻更敏感, 蓝藻致敏性与蓝藻无毒部分有关联 | [34] | |
| 病人血清和铜绿微囊藻有毒和无毒溶解物的酶联免疫吸附试验 | 2015 | 患者特异性IgE对无毒株的响应高于有毒株，过敏原为藻蓝蛋白和核心膜连接肽，无毒裂解物诱导大鼠嗜碱性粒细胞内释放β-氨基己糖苷酶.随着MCs浓度上升，无毒裂解物特异性IgE的产生受到抑制 | [35] | |
2.1 对红细胞的影响
红细胞可以识别、黏附、浓缩、杀伤抗原，清除循环免疫复合物，促进免疫细胞吞噬，其在血液中数量庞大，具有天然的免疫功能。红细胞膜表面存在许多免疫相关物质, 如补体受体CR1使其具有免疫黏附作用，过氧化物酶可直接产生杀伤作用[17]。Takahashi等[18]采用大鼠腹腔注射MC-LR观察到红细胞计数、血红蛋白浓度、红细胞压积呈剂量依赖性降低。Sicińska等[19]的人红细胞MC-LR体外暴露研究发现，1 nmol/L暴露导致膜的脂质过氧化，10 nmol/L时形成棘形红细胞，降低谷胱甘肽还原酶和超氧化物歧化酶活性，提高过氧化氢酶活性，使血红蛋白转化为高铁血红蛋白，降低细胞膜流动性，达到100 nmol/L时降低过氧化氢酶活性，形成活性氧簇(ROS)，出现溶血，红细胞膜和抗氧化酶的损伤可能是MC-LR与蛋白残基-SH直接共价结合的结果，间接与ROS的形成有关。Palikova等[20]用蓝藻提取物饲喂小鼠28 d也观察到暴露引起了红细胞血液学参数的改变。这些实验显示MC-LR暴露导致红细胞数量的下降和红细胞膜的损伤及抗氧化酶活性的改变，能损害人类红细胞的天然免疫功能。
2.2 对中性粒细胞和巨噬细胞的影响中性粒细胞和巨噬细胞参与人体的非特异性免疫。Hernandez等[21]在人类细胞体外试验观察到，MC-LR在1 nmol/L浓度时就出现外周血多形核白细胞的早期黏附显著增强。黏附是免疫吞噬过程的第1步，低浓度的MC-LR暴露可能就足以影响免疫系统，增强炎性反映，促进肿瘤发展。Shen等[22]的小鼠腹腔注射试验观察到，MCs暴露后腹腔巨噬细胞吞噬指数降低，而对吞噬百分率影响不明显，表明暴露影响巨噬细胞的吞噬能力。诱导型一氧化氮合酶(iNOS)协助巨噬细胞在免疫系统中对抗病原体，白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、趋化因子、生长因子等细胞因子与相应受体结合调节免疫细胞的生存、增殖、分化和死亡，调控免疫应答。Chen等[23]采用小鼠腹腔巨噬细胞体外培养发现，MC-LR抑制iNOS、IL-1β、TNF-α、IFN-γ和粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的信使RNA(mRNA)表达。Kujbida等[24-25]体外培养人和大鼠中性粒细胞试验显示，MC-LR、MC-YR、MC-LA暴露后，IL-8和ROS水平增加，增加细胞内钙水平诱导中性粒细胞趋化。袁改玲等[26]通过兔白细胞动力学评价研究MC-LR的免疫毒性效应发现，暴露改变了细胞因子水平而扰乱免疫系统并存在时间—剂量反应关系。核转录因子kB(NF-kB)活化后能进入细胞核与DNA结合诱导靶基因转录，调控参与免疫反应的细胞因子，是免疫和炎症反应的关键环节，调控失常可导致癌症、自身免疫和慢性炎症综合症。刺激信号从细胞膜表面受体转导至细胞核需活化细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)，ERK1/2信号通路与细胞增殖分化紧密相关。Adamovsky等[27]的小鼠巨噬细胞体外试验显示，低浓度MC-LR暴露，蛋白磷酸化酶(PP1和PP2A)并未受到抑制，但TNF-α水平提高，并诱发巨噬细胞激活NF-kB和ERK1/2，MC-LR可能通过Toll样受体2(TLR2) 刺激巨噬细胞。在肝细胞毒性研究中，抑制PP1和PP2A被认为是的主要机制之一，该试验表明低浓度MC-LR对巨噬细胞的免疫损伤有着不同的机制。这些试验表明MCs能扰乱免疫信号传导，干扰中性粒细胞和巨噬细胞免疫，低剂量经口暴露MCs可能对人类的非特异性免疫产生影响。
2.3 对淋巴细胞的影响淋巴细胞具有重要的机体特异性免疫应答功能。Chen等[23]的小鼠腹腔注射试验观察到，MCs暴露后脂多糖诱导的淋巴细胞增殖受抑制，抗体生成细胞数量呈剂量依赖性减少。Lankoff等[28-29]的人类外周血淋巴细胞DNA损伤修复的彗星试验表明，暴露后抑制辐射损伤修复，B细胞增殖受到抑制，仅在高浓度T细胞增殖减少。淋巴细胞相关的细胞因子在淋巴细胞免疫调控中发挥着至关重要的作用。Shi等[30]的小鼠腹腔注射蓝藻水华提取物试验观察到，TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-4的mRNA表达水平下降，IL-6不受影响，研究者在已有知识的基础上通过数学建模来模拟T辅助细胞(Th1、Th2) 数量变化与相关细胞因子(IL-2、IL-4、IL-10) 表达水平之间的相互作用，结果实验数据和数学模型预测相似，验证了蓝藻水华提取物暴露下的T辅助细胞活化与细胞因子网络调节的相互作用模型。Teneva等[31]的MC-LR诱导小鼠淋巴细胞凋亡试验显示，B细胞凋亡可能是通过抑制B细胞表面抗原受体或生长因子诱导的，而T细胞则不受影响。Zegura等[32]的人外周血淋巴细胞MC-LR暴露试验显示，MC-LR通过诱导氧化应激间接影响淋巴细胞DNA的损伤修复，损伤呈剂量时间依赖性增加，并改变人类抑癌基因p53的mRNA表达。γδ+T淋巴细胞杀伤活性强，具有抗感染、抗肿瘤作用。Palikova等[20]的蓝藻提取物喂饲小鼠试验观察到外周血中NK细胞和γδ+T淋巴细胞显著增加。骨髓是免疫细胞的发源地和B细胞发育、分化、成熟的场所。Zhou等[33]的小鼠腹腔内注射MC-LR观察到骨髓细胞微核频率显著升高，骨髓细胞增殖显著下降。MCs暴露损伤淋巴细胞DNA，调整细胞因子mRNA表达，影响淋巴细胞的亚群生成和增殖水平，可能影响人类的特异性免疫。
2.4 对人类过敏反应的影响Bernstein等[34]对259名(7~78) 岁慢性鼻炎2年以上患者的脱毒蓝藻试剂皮肤致敏研究，通过皮肤试验和皮肤点刺试验(SPT)评价患者对变应原的反应，首次发现蓝藻的致敏性与蓝藻的无毒部分有关联。Geh等[35]用病人血清和铜绿微囊藻有毒、无毒的超声裂解物进行酶联免疫吸附试验发现，蓝藻无毒株比有毒株更易引起过敏患者的过敏反应，过敏原为藻蓝蛋白和核心膜连接肽，并观察到MCs抑制对过敏原的过敏反应，试验人员认为有必要进一步调查不同蓝藻的免疫原性和毒性之间的相互作用。
3 当前的认知和研究需求目前已有的试验结果提供了一些MC-LR免疫毒性相关的重要效应信息。主要有：① 导致红细胞数量下降，脂质过氧化，膜流动性降低，改变谷胱甘肽还原酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的活性，形态改变，形成ROS，出现溶血，损害人类红细胞的天然免疫功能；② 外周血多形核白细胞的早期黏附显著增强，诱导中性粒细胞趋化，TNF-α水平提高，诱发巨噬细胞激活NF-kB和ERK1/2，降低iNOS和部分细胞因子的mRNA的表达水平，干扰免疫信号转导；③ 影响淋巴细胞的亚群生成和增殖水平，抑制B淋巴细胞增殖，诱导氧化应激间接影响淋巴细胞DNA的损伤修复，骨髓细胞微核频率显著升高；④ 可能抑制人类对过敏原的过敏反应。这些效应虽然足以表明MCs暴露造成了正常免疫机制的紊乱，具有免疫毒性，但由于人类免疫机制的复杂性，显然有限的体外或动物模型试验观察尚未能揭示其免疫毒性的全貌，仅为错综复杂的因果关系链的粗略或局部。尽管近年来基因组学和蛋白组学的研究明显增多[36-37]，但仍无法全面解释已观察到的免疫毒性效应背后的生化或分子机制。已有的试验研究主要集中在MC-LR，其他MCs同系物的免疫效应研究很少，MCs免疫毒性的很多问题尚未探明。
回顾以往MCs暴露对免疫系统影响的研究，一些因素制约了MCs免疫毒性的认知。由于藻毒素鉴定和定量分析检测方法的限制，部分试验使用蓝藻提取物进行暴露研究，可能存在其它活性物质干扰，或者MCs同系物成份定量信息不清，这些试验未能避免潜在未知暴露因素对试验结果的影响，增加了研究结论的不确定性。MC-LR和硝酸钠的联合暴露试验显示联合暴露产生了明显更严重的毒理学损伤[38]，饮水中某些物质的存在可能影响MCs毒性的发挥，具有协同或拮抗作用的物质应予以关注和研究。流行病学调查能直接证明暴露和人类健康的关系，以往的研究主要局限于体外和动物模型试验，长期暴露影响的流行病学调查主要报道了MCs对肝脏的损伤[39]，尚未见对人类免疫相关影响的研究报道，MCs免疫毒性的鉴定与评估尚缺乏人类流行病学数据的支持，因此需要开展某些可能与免疫失调相关的疾病或特定人群的人类流行病学调查，如哮喘[40]、白内障[41]、类风湿性关节炎[42]、系统性红斑狼疮[43]等，也包括癌症[44]，特定人群主要有6岁以下儿童、老年人、免疫力低下和高暴露人群等，进一步了解和证实MCs低剂量长期暴露对人类免疫系统的不良健康影响，对开展人类MCs暴露的健康风险评价极其重要。
MCs的细胞毒性研究表明，低剂量能激活ERK1/2信号通路诱导细胞增殖[45]，并诱发保护性的细胞自噬[46]，而高剂量引起细胞凋亡。MCs对免疫系统的影响主要体现在低剂量就能干扰免疫细胞的功能稳定和免疫信号的正确传递，影响免疫防护功能正常发挥。部分试验已经显示了低剂量与高剂量组免疫效应的差异，某些效应仅在高剂量时出现，如兔白细胞动力学研究中外周血WBC和细胞因子水平的变化[26]，人红细胞体外培养试验中MC-LR在1和10nM时过氧化氢酶活性增加，100 nmol/L和1000 nmol/L时过氧化氢酶活性降低，仅在100 nmol/L以上观察到形成ROS和溶血[20]。相应免疫效应的阈值如何，以及某些效应是否存在非单调剂量反应关系值得关注。我国部分地区出厂水多有1 μg/L(约1 nmol/L)以下的MC-LR残留[5]，WHO推荐的MC-LR指导值主要是基于小鼠13周试验中观察到的肝脏病理改变，并没有考量免疫毒性的影响[14, 47]。面对人群长期低剂量暴露的现实，试验研究和流行病学调查应更多关注低水平长期暴露对正常免疫系统的影响，以指导健康风险管理和疾病预防决策。
体内体外试验观察到的MCs暴露对免疫系统的影响，仅表明暴露与效应的关联，尽管有部分研究者对暴露及相关效应之间的关系给出了合理的解释，但解释缺乏相应证据支持并不确定，仍需针对可能的机制，特别是相关分子机制，积累数据进一步验证。未来的研究需要澄清MCs诱导免疫毒性发展所涉及事件的整个因果连接及其调控机制，以及相应不同生物活性分子及包含特异受体的效应靶细胞之间的交叉应答及协同/互动。MCs毒性相关的microRNA研究进行了表达谱的鉴定[37]，后续研究应更多地查明其下游靶基因的相应变化，更重要的是进一步阐明相应改变的生物学意义[48]。值得注意的是，人类免疫功能的发挥高度依赖免疫信号的传递，细胞因子在免疫信号网络中极其关键，有强力免疫调节活性，在调节炎症反应、过敏易感性和肿瘤免疫方面有着重要的作用，MCs长期低水平暴露影响其水平改变，如TNF、IFN等，形成持续免疫刺激，信号转导调控异常，间接影响正常生理过程，对人体健康产生长期负面影响，可能与一些慢性疾病或癌症的发生与发展有关，在免疫毒性机制研究中应予以重点关注。
4 结语随着全球气候变暖和水华频繁发生，在解决水源蓝藻水华问题或找到经济有效的水处理技术去除MCs之前，长期低水平暴露将是人类不得不面对的现实[49]。MCs的肝毒性和致癌性已被广泛研究，但对人类免疫系统的影响我们知之甚少，以往研究中有关其免疫毒性的证据提示长期低水平饮水暴露能影响人类正常的免疫功能，与一些疾病的发生与发展可能有潜在的联系，存在进一步深入调查研究的需求，期望有更多面向需求的多学科研究填补我们认知的缺口，为临床治疗、疾病预防和饮水安全决策提供支持。
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