2. 新疆维吾尔自治区环境监测总站
大气细颗粒物(PM2.5)是指固体和液体微粒均匀地分散在空气中形成的相对稳定的悬浮微粒。PM2.5与PM10和TSP相比具有更大的比表面积和更强的吸附性，且可以长时间在大气悬浮而不沉降，更有机会在其表面吸附大量的包括各种重金属、有机物和无机物、多环芳烃类、甲醛、二氧化硫和氮氧化物等在内的一些有毒有害物质和各种病原微生物。这些物质在细颗粒物中富集的同时由于PM2.5自身粒径小，可以更深入地进入肺部，到达肺泡。或者通过血液循环到达其它器官，引起呼吸、心血管、免疫等系统的损害[1-2]，研究证实其中有些物质具有遗传毒性甚至致癌[3-4]。氧化应激引起的氧化损伤是目前人们推测的大气细颗粒物(PM2.5)的可能毒性作用机制之一[5]，PM2.5具有产生活性氧(ROS)的能力，这一观点认为呼吸系统、循环系统的损伤与活性氧(ROS)的产生有密切的联系，当机体抗氧化能力减弱或氧化应激增强时自由基引起的氧化损伤与一系列的疾病损伤及致病机理有关联。本文研究PM2.5中不同成分对BEAS-2B的毒性，并探讨可能的毒作用机制。
1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂 1.1.1 仪器及材料ThermoAndersonG-2.5大流量采样器(美国热电子公司)，马弗炉(SXC-2-12，杭州蓝天)；CO2恒温培养箱(371，日本SANYO)；超净台(SW-CJ-2F，上海智域分析仪器公司)；倒置显微镜(IX71-12FL/PH，日本Olympus公司)；离心机(BR4i型，美国Beckman公司)超声微波震荡器(上海青浦泸西仪器厂)；超纯水仪(MILLI-Q BIOCEL，美国Millipore公司)；全自动细胞计数仪(2C08351P，Korea)；低温冷冻离心机(3K15，Sigma)；玻璃纤维滤膜(河北省故城县环境监测器材厂)。
1.1.2 试剂1640培养基(AAJ206662，美国HyClone公司)；DMSO(Q2259，美国Sigma公司)；MTT(M5178，美国Sigma公司)；胎牛血清(41G5741K，美国Gibco公司)；乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒(南京建成生物技术有限公司)；DHR-ROS测定试剂盒(南京建成生物技术有限公司)，其他试剂均为国产分析纯试剂。
1.2 细颗粒物的采集和处理 1.2.1 采样地点采样地点为乌鲁木齐市新市区某学校建筑物楼顶，楼顶距离地面高度约为20 m，周围无工业污染源和排放源(此采样点在乌鲁木齐市环境监测站附近)。
1.2.2 采样时间从2014年9月1日开始采样，至2014年10月14结束。采样期间为非采暖期，每个月选取有代表性的时间段进行连续采样。采样时间设定为24 h(当日10:00—次日10:00)。下雪、下雨及刮风等极端天气不进行采样。采样仪器自动记录每次采集过程中大气压、采集时间、平均温度、累计体积、标况体积等条件因素。共采集17份样品，采样点PM2.5质量浓度范围(90.3~193.0) μg/m3。
1.2.3 样品处理Thermo Anderson G-2.5大流量采样器采用玻璃纤维滤膜采集大气细颗粒物[6]。将载有细颗粒物的滤膜裁剪为(1×3) cm大小，浸入去离子水中，超声振荡30 min×3次，洗脱细颗粒物，振荡液用六层纱布过滤，滤液冷冻真空干燥，低温冰箱保存备用。染毒时，用生理盐水配制成相应的浓度，并且超声振荡混匀灭菌。
1.3 溶液配制配制浓度为500 μg/mL、1 000 μg/mL、2 000 μg/mL和3 000 μg/mL的细颗粒物悬浊液，充分混匀，于4℃静置过夜，然后离心(1 500 g/min，20 min)，取上清液作为该浓度的水溶成分；对离心后的沉淀用相同体积的0.9%生理盐水重悬，作为细颗粒物在该浓度的非水溶成分。染毒时不同成分的浓度按所需浓度进行稀释配比，染毒终浓度为：50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL和300 μg/mL。
1.4 细胞株人肺正常上皮细胞株BEAS-2B细胞，由广州吉尼欧生物科技有限公司提供。
1.5 细胞的培养方法从液氮保存罐中取出BEAS-2B细胞冻存管，立即放入37℃水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化，此过程在(1~2) min完成。将细胞悬液移入离心管，缓慢加入5 mL培养液，于l 000 g/min离心8 min。用培养液混悬沉淀细胞，调整细胞密度(105个/mL)，接种于培养瓶中，置于5% CO2，37℃恒温培养箱中培养。
1.6 MTT法检测细胞增殖[7]收集细胞，调整细胞密度，按5×105个/mL接种100 μL细胞悬浮液于96孔培养板，置于含5% CO2的37℃培养箱中避光孵育4 h，待细胞生长进入对数期，按照不同浓度梯度加入重金属或阴离子标准液、PM2.5水溶成分或非水溶成分。设正常对照及空白对照(不加细胞只加培养液)。将96孔板置于含5% CO2的37℃培养箱中避光孵育，染毒24 h。每孔加入10 μL MTT染色溶液，继续培养4 h，各孔加入100 μL Formanzan溶解液，置摇床上低速震荡(10~30) min，充分溶解结晶物。室温下静置10 min后用酶联免疫检测仪于570 nm处测量各孔的吸光度值(OD值)，并计算细胞存活率。
1.7 细胞内LDH含量的测定[7]将100 μg的1×105个/mL细胞接种于96孔平底培养板上，培养生长至80%~90%融合后，除去细胞培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞3次，然后加入细颗粒物水溶成分或非水溶成分的不同染毒梯度的染毒液，染毒24 h后，立即用PBS缓冲液冲洗3次，然后在室温按照乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒实验步骤要求进行操作后，于波长450 nm处用酶标仪测定吸光度，计算细胞内LDH活性。
1.8 细胞内活性氧(ROS)含量的检测[7]将100 μg的1×105个/mL细胞分别接种于24孔平底培养板和6孔平底培养板上，细胞培养生长至80%~90%融合，用PBS缓冲液冲洗3次，然后同时加入DHR荧光探针和细颗粒物水溶成分或非水溶成分，空白对照组加入阳性对照诱导剂，以便于活性氧的对比检测。染毒浓度分别为50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL和300 μg/mL，每组设3个平行孔。染毒1 h后，24孔平底培养板用PBS缓冲液冲洗3次，置于荧光显微镜(滤光片波长：Ex=488 nm；Em=530 nm)下观察荧光强度及荧光分布。6孔平底培养板用0.05%的胰蛋白酶消化得到细胞悬液，用PBS缓冲溶液将细胞洗脱，计数细胞数量，用荧光分光光度计分别测定水溶成分和非水溶成分染毒组的荧光强度(Ex=488 nm；Em=530 nm)。
1.9 统计学方法用SPSS 17.0软件包对数据进行录入和分析处理，测得数据均用(x±s)差表示。满足正态分布两组间比较采用采用单因素方差分析，方差齐性用Least-significant difference进行检验，组间比较用Student-Newman-Keuls法检验。
2 结果 2.1 PM2.5水溶成分和非水溶成分对细胞活性的影响随着染毒浓度的不断升高，PM2.5水溶成分和非水溶成分都对细胞活性产生抑制，其中水溶成分使BEAS-2B细胞活性下降的程度比非水溶成分使BEAS-2B细胞活性下降程度更明显。在相同的染毒剂量下，非水溶成分细胞的抑制程度明显低于水溶成分对细胞的活性抑制程度(P < 0.01；表 1)。
| 剂量/ (μg/mL) |
细胞存活率/% | |
| 细颗粒物水溶成分 | 细颗粒物非水溶成分 | |
| 0 | 99.3±2.0 | 99.0±2.2 |
| 50 | 92.9±2.4*▲ | 101.4±2.3 |
| 100 | 81.2±7.3*▲ | 100.2±1.5 |
| 200 | 60.4±5.1*▲ | 97.5±1.3* |
| 300 | 51.1±1.8*▲ | 94.6±1.2* |
| 注：*与对照组比较，P < 0.01；▲水溶成分与非水溶成分相统计量比较，P < 0.01 | ||
2.2 PM2.5水溶成分和非水溶成分对细胞膜损伤程度的影响
随着染毒剂量的不断增加，PM2.5水溶成分可以明显降低BEAS-2B细胞内LDH的含量，对细胞膜有较强的损伤作用；而非水溶成分同样使BEAS-2B细胞内LDH含量轻度下降，对细胞膜的损害程度在相同的染毒剂量下，明显低于水溶成分(P < 0.01；表 2)。
| 剂量/ (μg/mL) |
LDH释放量/% | |
| 细颗粒物水溶成分 | 细颗粒物非水溶成分 | |
| 0 | 100 | 100 |
| 50 | 97.7±3.4 | 98.5±3.6 |
| 100 | 95.6±3.8 | 97.9±3.1 |
| 200 | 85.3±4.6*▲ | 96.2±2.0 |
| 300 | 75.1±7.2*▲ | 94.3±6.9* |
| 注：*与对照组比较，P < 0.01；▲水溶成分与非水溶成分相统计量比较，P < 0.01 | ||
2.3 PM2.5水溶成分和非水溶成分对细胞内活性氧(ROS)的影响
用荧光倒置显微镜观察细胞内荧光显色(图中细胞内的白色代表荧光，颜色越亮荧光强度越强)。结果显示对照组BEAS-2B细胞内荧光显示较少，染毒后细胞内荧光强度明显增加，并且高浓度组的荧光强度明显高于对照组和低浓度组；相对于PM2.5非水溶成分组细胞，相同浓度组的水溶成分染毒组细胞内的荧光强度较强(图 1)。
|
| 图 1 PM2.5不同成分细胞内产生ROS的荧光显微镜观察 |
随着染毒浓度的增加，细胞内产生的ROS显著增加(P < 0.01)，并且水溶成分诱导产生ROS的能力明显比非水溶成分强(P < 0.01；表 3)。
| 剂量/ (μg/mL) |
荧光强度(×10-4) | |
| 细颗粒物水溶成分 | 细颗粒物非水溶成分 | |
| 0 | 85.9±2.3 | 85.9±2.3 |
| 50 | 93.7±1.6 | 93.3±2.2 |
| 100 | 186.0±3.1*▲ | 138.0±13.8* |
| 200 | 275.3±44.3*▲ | 164.7±29.5* |
| 300 | 450.0±32.8▲ | 179.2±21.2* |
| 注：*与对照组比较，P < 0.01；▲水溶成分与非水溶成分相统计量比较，P < 0.05 | ||
3 讨论
通过提取大气细颗粒物中的水溶成分和非水溶成分，配制成不同浓度的染毒液，染毒BEAS-2B(人肺正常上皮细胞)后，细胞形态发生异常增殖现象，且染毒浓度越高变化越明显。Pope等[4]发现，大气颗粒物可诱导人肺泡上皮细胞中转录因子NFkB活化，而NFkB会进一步引发人肺上皮细胞的氧化应激损伤反应并同时诱导细胞增殖，使得细胞发生突变的几率明显增加，且同时发生异常的增殖现象。结合Pope等[4]发现和本次研究的成果，可以看出大气细颗粒物可导致BEAS-2B(人肺正常上皮细胞)形态发生变异，这可能增加后续癌变反应发生的风险。而通过检测乳酸脱氢酶(LDH)可以反映出毒物对细胞膜的破坏程度，试验结果显示随着对细胞的染毒浓度不断升高，细颗粒物水溶成分染毒组中BEAS-2B细胞内乳酸脱氢酶的含量明显降低，在相同的染毒剂量下，非水溶成分染毒组的BEAS-2B细胞内乳酸脱氢酶含量下降的程度明显低于水溶成分组(P < 0.01)。
细胞内活性氧(ROS)水平被研究证实是造成该组细胞凋亡的主要原因之一。用所提取的大气细颗粒物的不同浓度非水溶成分进行染毒BEAS-2B人肺正常上皮细胞后，检测细胞内ROS的水平，结果显示细颗粒物水溶成分染毒组细胞内ROS的水平明显高于非水溶成分组，这说明水溶成分更加容易诱导细胞内ROS的形成。细胞内ROS的水平是因为细胞线粒体的活性随着水溶成分浓度的升高而受到了明显的抑制，从而导致细胞死亡情况也在不断加重；而非水溶成分组对细胞活性的影响比水溶成分组的小。本次实验中，使用的是正常人肺上皮细胞株BEAS-2B细胞，由于BEAS-2B细胞没有吞噬功能，因此非水溶成分对其影响较小，而水溶成分中的过渡金属离子、生物活性成分等物质，可以通过诱导自由基的产生，以及其自身的毒效应对细胞活性产生明显的抑制作用。因此当细颗粒物通过呼吸道进入呼吸系统后，非水溶性成分可以直接激活细胞诱导炎症细胞聚集，而细颗粒物的水溶成分可以同过诱导巨噬细胞和肺部实质细胞产生自由基，从而对肺部造成损伤[8]。以上结果提示，大气细颗粒物水溶成分染毒组和非水溶成分组对于正常人肺上皮细胞株BEAS-2B细胞的毒性大小有明显的差异，对机体的损伤机理及损伤的程度也存在明显差异。
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