2. 北京飞机维修工程有限公司
国际上尤其是发达国家对客舱内环境空气质量高度重视，其中空气微生物污染是重要研究内容。空气微生物是存在于空气中的微生物总称，包括真菌、细菌、放线菌及低等藻类等肉眼不可见的生物，是生态系统的重要组成部分[1]。美国联邦航空局已经组建了多领域卫生专家参与的民航飞机座舱空气质量卓越委员会 (ACER)，主要进行航空空气污染物毒性及其对健康危害等方面的评价研究。
目前大型客机一般都安装高效空气过滤器 (HEPA)，能净化部分微生物、悬浮颗粒物等。飞机空调引气的主要来源有发动机引气、APU引气、地面空调车。本研究通过初步分析我国民用航空器座舱内高效空气过滤器再循环风扇滤网中的空气微生物菌属特征，为我国航空器客舱内消毒剂筛选使用及空气微生物分布特征研究提供参考。
1 材料与方法 1.1 设备PCR仪 (美国ABI公司9700);凝胶成像分析仪 (美国伯乐BIO-RAD)。
1.2 培养基与试剂菌落培养:沙氏琼脂培养基 (路桥公司)、营养琼脂培养基 (路桥公司)、脱脂海绵涂抹棒 (友康公司)、0.85%生理盐水及试管 (友康公司)。
微生物鉴定材料:Taq DNA聚合酶 (Takara公司); DNA标记 (DNA Marker，Takara公司)、脱氧核糖核苷三磷酸 (dNTP，上海生工)。
1.3 采样与培养方法 1.3.1 采样方法采用涂抹法采集2架飞机高效过滤器滤网，用0.85%生理盐水脱脂海绵拭子涂抹棒倾斜30度涂抹再循环风扇滤网表面积10 cm2 (5 cm×2 cm) 两遍，将海绵涂抹棒放入装有0.85%生理盐水10 mL试管中摇匀，待检样品在低温保存2 h内送检，共采集培养96个样本。
采集波音B737-800飞机 (机龄2.6年) 再循环风扇1个立体滤网的表面不同位置，其进风面使用海绵涂抹棒采集23个样本后，分别放入23个10 mL 0.85%生理盐水试管中，摇匀后每管吸取1 mL后用于培养真菌样本; 从该23个10 mL试管中挑选采样位置有代表性的14个10 mL试管溶液，分别吸取1 mL溶液后用于培养细菌样本。
该滤网出风口面使用海绵涂抹棒10个涂抹采样后，分别放入10个10 mL 0.85%生理盐水试管中，摇匀后每管吸取1 mL溶液后用于培养真菌样本; 从该10个10 mL试管中挑选有位置代表性的5个10 mL试管溶液，分别吸取1 mL溶液后用于培养细菌样本。
采集波音B737-800飞机 (机龄10.1年) 再循环风扇1个滤网表面进风面、出风面各11个涂抹棒，共22个涂抹棒，放入22个10 mL 0.85%生理盐水试管中，混匀后每个试管吸取1 mL用于培养细菌总数，再在该同一试管中吸取1 mL用于培养真菌总数，其中培养细菌样本22个，真菌样本22个。
1.3.2 培养方法各送检样本 (混有棉拭子涂抹棒的10 mL 0.85%生理盐水样本溶液) 分别吸取1 mL采样液体直接滴入待检平板中，其中营养琼脂平板用于细菌检测，沙氏琼脂平板用于真菌检测。分别用无菌涂抹棒涂抹平板，细菌总数样本37 ℃培养48 h，真菌总数样本28 ℃培养3 d后进行菌落计数，按公式 (1) 计算含菌量x:
| $x = (N \times F \times D)/A$ | (1) |
式中:x—含菌量，个/cm2;
N—即用型培养皿 (路桥) 培养所得出的菌落计数结果，个;
F—采样管内液体的总体积，mL;
A—采样总面积，cm2;
D—稀释倍数。
1.4 微生物鉴定方法采样后的细菌样本经培养后根据菌落颜色、形态、大小，肉眼观察筛选4种不同的单菌种，37 ℃恒温培养48 h后，提取基因组DNA为模板，PCR扩增细菌16S rDNA片段，通过对16S rDNA测序进行菌种鉴定。
采样后的真菌样本经培养后根据菌落颜色、形态、大小，肉眼观察筛选16种不同的单菌种，28 ℃恒温培养5 d后，提取基因组DNA为模板，PCR扩增真菌ITS片段，通过对ITS片段测序进行菌种鉴定。
1.4.1 实验上机流程将检测合格的样本经过PCR扩增、混样、建库并做相应的检测。检测合格的文库将采用Illumina Miseq高通量测序平台对样本进行测序，测序得到的下机数据 (Raw Data) 将用于后期信息分析。
1.4.2 信息分析流程针对Miseq测序数据进行环境微生物的16S分析。首先对原始的paired-end reads进行过滤得到高质量reads，然后通过序列拼接得到较长的序列，将其与16S参考数据库作比对，同时去除嵌合体序列，最终将过滤后的序列按照一定的阀值进行归类，得到多个序列聚类操作分类单元 (OTUs)，并对OTUs进行分类学 (taxonomy) 注释。根据OTUs结果进行alpha和beta多样性的计算，其中alpha多样性是指单个样本的多样性，beta多样性是指样本间的相似性和差异模式。
1.5 数据处理方法用SPSS 18.0统计软件，对样本结果数值进行对数数据转换，再进行两组样本的t检验，分析再循环风扇滤网进风口表面和出风口表面两组的滤网表面每平方厘米细菌总数、真菌总数，进行两组间差异是否有统计学意义检验，同时对同一架飞机再循环风扇滤网进风口面的细菌总数与真菌总数进行两样本t检验，分析两架飞机不同机龄之间空调分配仓滤网表面细菌总数、真菌总数等指标差异是否有统计学意义。
2 结果 2.1 菌落总数经公式 (1) 计算，B737-800飞机 (机龄2.6年) 进风口表面含细菌总数平均为69 CFU/cm2，真菌总数平均为97 CFU/cm2; 出风口表面含细菌总数平均为0 CFU/cm2，真菌总数平均为1 CFU/cm2，所有空白对照均为0 (表 1)。B737-800飞机 (机龄10.1年) 进风口表面细菌总数平均为295 CFU/cm2，真菌总数平均为261 CFU/cm2; 出风口表面含细菌总数平均为1 CFU/cm2，真菌总数平均为0 CFU/cm2，所有空白对照均为0 (表 2)。
| 菌落总数 | 采样位置 | 样本数/个 | 含菌量均值 | 标准差 | 极小值 | 极大值 | 中位数 | 四分位数间距 | t | P |
| 细菌总数 | 进风面 | 14 | 69 | 16 | 40 | 95 | 70 | 57~81 | 38.02 | 0.000 |
| 出风面 | 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| 真菌总数 | 进风面 | 23 | 97 | 41 | 30 | 185 | 85 | 65~125 | 20.33 | 0.000 |
| 出风面 | 10 | 1 | 2 | 0 | 5 | 0 | 0 | |||
| 注：菌落总数计数单位为CFU/cm2 | ||||||||||
| 菌落总数 | 采样位置 | 样本数/个 | 含菌量均值 | 标准差 | 极小值 | 极大值 | 中位数 | 四分位数间距 | t | P |
| 细菌总数 | 进风面 | 11 | 295 | 97 | 150 | 465 | 295 | 235~315 | 20.89 | 0.000 |
| 出风面 | 11 | 1 | 2 | 0 | 5 | 0 | 0 | |||
| 真菌总数 | 进风面 | 11 | 261 | 76 | 175 | 380 | 240 | 185~340 | 62.86 | 0.000 |
| 出风面 | 11 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| 注:菌落总数计数单位为CFU/cm2 | ||||||||||
2.2 再循环风扇滤网表面细菌总数与真菌总数相关性分析
对一架波音飞机B737-800 (机龄10.1年) 空调分配仓高效再循环风扇滤网表面细菌总数与真菌总数相关性分析发现，双侧检验结果P=0.052, P > 0.05，两者差异无统计学意义，说明两者间没有相关性，即真菌总数不会随着细菌总数的增加而增加，反之亦然。
2.3 不同机龄空调分配仓滤网表面细菌总数、真菌总数结果比较机龄2.6年与机龄10.1年B737-800飞机的再循环风扇滤网进风口表面细菌总数的中位数分别为70 CFU/cm2和295 CFU/cm2; 真菌总数的中位数分别为85 CFU/cm2和240 CFU/cm2。经对数转换后进行独立样本t检验，两架飞机再循环风扇滤网进风口表面的细菌总数 (t=-12.27，P=0.00)、真菌总数 (t=-6.77，P=0.00) 两指标差异有统计学意义。
2.4 分子生物学鉴定结果该架波音飞机B737-800空调分配仓高效空气过滤器再循环风扇滤网采集培养的细菌菌落、真菌菌落进行肉眼观察筛选，再分离培养出15例真菌菌落和2例细菌菌落，对该17个菌落再进行单菌种的接种培养后，进行分子生物学鉴定，发现真菌鉴定结果为球腔菌属、小光壳属、曲霉菌属、枝孢属、青霉菌属五种，其中曲霉菌属包括爪甲曲霉、泡盛曲霉和黑曲霉，青霉菌属有产黄青霉菌; 细菌鉴定结果为芽孢杆菌 (表 3)。
| 编号 | 微生物数据库比对鉴定 BLAST结果英文名称 |
相对应的中文名称 |
| 真菌英文名称 | 真菌中文名称 | |
| 1 | Mycosphaerella sp. | 球腔菌属 |
| 2 | Leptosphaerulina | 小光壳属 |
| 3 | Aspergillus | 爪甲曲霉，曲霉菌属 |
| 4 | Uncultured fungus | 难以培养的真菌 |
| 5 | Uncultured fungus | 难以培养的真菌 |
| 6 | Uncultured fungus | 难以培养的真菌 |
| 7 | Cladosporium sp. | 枝孢属 |
| 8 | Cladosporium sp. | 枝孢属 |
| 9 | Penicillium sp. | 青霉菌属 |
| 10 | Cladosporium cladosporioides | 芽枝状枝抱霉 |
| 11 | Fungal sp.Griff | - |
| 12 | Penicillium chrysogenum | 产黄青霉菌 |
| 13 | Aspergillus sp. | 曲霉属 |
| 14 | Aspergillus awamori | 泡盛曲霉 |
| 15 | Aspergillus niger | 黑曲霉 |
| 细菌英文名称 | 细菌中文名称 | |
| 16 | Uncultured bacterium clone | 未得到培养物的细菌 |
| 17 | Bacillus | 芽孢杆菌 |
3 讨论
由于客舱环境相对封闭狭小拥挤[2]，航空器客舱内空气微生物往往粘附在悬浮颗粒物上，可以较长时间停留在空中，或随风飘荡传播到较远位置，增加乘客和机组人员健康感染某些传染性疾病的风险，并且常与环境中其它污染物协同作用，致使环境卫生进一步恶化，降低舱内空气质量，对乘客及机组人员健康造成不良影响。
呼吸过敏症状通常与空气中各种属的真菌有关，枝孢属、链格孢属、曲霉属菌等是能引起人们皮肤过敏性反应的最常见真菌。中国台湾呼吸性疾病的发生流行与空气中枝孢菌浓度的增加有关[4]。空气中真菌孢子的浓度升高，可以使人体肺功能降低，增加感冒、呼吸急促、哮喘等呼吸性疾病，慢性肺部疾病，心血管疾病和肺癌等的患病概率[5]。因此，本文重点通过分析高效过滤器滤网中真菌、细菌等菌落总数的计算结果及菌属的初步鉴定，为飞机实际过滤效果评价提供一定参考，从而保障旅客和机组人员的环境健康。空气高效过滤器滤网出风口内表面真菌总数和细菌总数均符合公共场所集中空调通风系统风管内表面的限值要求[3]，均小于100 CFU/cm2。
国外报道关于座舱内环境空气菌落总数的研究多集中在座舱空气菌落总数浓度的分析。Wick等[6]在42个航班上使用离心式空气采样器收集细菌总数和真菌总数空气样本，其中航班包括多个机型:波音飞机B727、B737、DC10、MD80。座舱中空气细菌浓度范围是 (9~282) CFU/cm3。Dumyahn等[7]使用便携式Burkard细菌培养板在B-777飞机上采样，细菌浓度结果的几何均数为201 CFU/cm3。Lee等[8]则研究了B-747飞机3个航班上的细菌浓度。通过使用Burkard空气采样器收集样本，结果发现细菌浓度是 (33~93) CFU/cm3，并且观察到登机阶段比巡航阶段浓度要高。Pierce等[9]在新型B-777飞机8个航班上使用便携式空气采样器 (Rodac) 收集中程航线和长航线航班的细菌样本，结果发现细菌浓度是 (39~244) CFU/cm3。McKernan等[10]通过评估12架宽体飞机客舱内空气微生物真菌总数研究发现，机场航站楼外与飞机客舱内空气真菌总数差异有统计学意义，同时结论表明绝大多数真菌总数暴露高峰阶段出现在起飞、降落、停航及旅客活动阶段。虽然上述研究都各有不同，但均没有进行菌落鉴定方面的分析。而LAURALYNN等[11]则还进行了波音767双通道宽体客机内空气真菌菌种鉴定，在2002年夏季随机抽样12架次航班六个阶段 (登机、起飞爬升、早期巡航、中期巡航、晚期巡航、降落) 持续采样4.5 h~6.5 h，飞机新风量50%，乘客上座率67%~100%，使用6级筛采集真菌。结果显示样本优势菌种是枝孢属、担孢子、青霉菌、曲霉菌，其中枝孢属、青霉菌、曲霉菌这三个菌属，与本次研究中高效过滤器滤网表面的五个菌属中的三个一致。同时，本研究还发现滤网中另外两个真菌属为球腔菌属、小光壳属。目前，国内外文献关于飞机高效过滤器滤网表面微生物的研究几乎未见报道。本研究通过采集飞机高效过滤器滤网表面微生物样本，初步了解滤网表面微生物菌属构成情况，从而为评价该两架飞机高效过滤器空气微生物过滤效果及常规消毒效果提供一定参考。
4 结论本研究为评价座舱内空气质量过滤效果提供了一定参考。滤网出风口面较进风口面卫生，可间接推断高效空气过滤器的过滤效果良好，故飞机预防性常规消毒效果评价应重点关注飞机座舱内座椅、配餐间、卫生间等的物表污染状况，其次是空气污染。
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