尿样是重要的生物材料之一，因其收集简便、对人体无损伤性、样品量大，是除血液外医学生物监测工作中最常用的生物样品。在测定尿中金属毒物和其代谢产物的浓度用以评价机体内环境污染物的负荷时，尿中的金属毒物易受水、运动等因素的影响。

肌酐是肌肉在人体内代谢的产物，仅经肾小球过滤而不被肾小管重新吸收，其中尿肌酐排泄最为稳定，可以用作尿中其他排泄物浓度的校正参数。为了减少或消除尿样稀释或浓缩对毒物浓度造成的差异，准确测定尿中有毒重金属元素的含量，1980年世界卫生组织建议以尿肌酐为参数校正尿中重金属毒物的浓度。因此，尿中肌酐的准确测定在生物监测工作中越来越重要。

目前国内测定尿肌酐的分析方法中多采用酶法和分光光度法。人体中高浓度的胆红素对酶法有正向干扰^[1-6]，且酶法需在生化分析仪上操作^[7-8]，不适用在体检现场开展测定工作。《中华人民共和国卫生行业标准》（WS/T 97 - 1996）^[9]规定使用的方法为分光光度法，但国标中的分光光度法加液、定容步骤繁杂。测定范围窄，测定范围仅为0 g/L ~ 1.0 g/L。而人群中尿肌酐正常的含量浓度范围为0 g/L ~ 3.0 g/L，使用国标规定的方法测定尿中肌酐含量，当肌酐含量超过1.0 g/L后将无法进行检测，且显色反应时间长，一般为30 min。本文改进了碱性苦味酸分光光度法，在体检现场采集尿样后使用便携式分光光度计立即测定尿肌酐含量，保证了生物样品测定的时效性。本法简化了实验操作步骤，仅用3支加样枪完成取样、标准曲线配制、显色液加入等实验步骤，反应时间缩短为15 min ~ 20 min，操作简便、快速。定量加液也同时提高了实验的灵敏度和准确度。本实验测试范围为0 g/L ~ 2.0 g/L，可以适用于大多数人群尿肌酐含量的测定。便携式分光光度计携带方便，比酶法生化仪测定尿肌酐成本低廉，适合流行病学调查现场测定，为分析生物样品中有毒金属浓度水平提供了基础数据。

1 材料与方法 1.1 原理

肌酐与过量苦味酸在碱性条件下反应生成橙红色苦味酸肌酐。在波长490 nm处比色定量。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

分光光度计（北京普析通用仪器有限公司pors-15型便携式），瓶口分配器(Dispensette®Organic)，涡旋振荡器(Vortex-Genie 2)，50 μL移液器(Eppendorf)，200 μL移液器(Eppendorf)，1 000μL移液器(Eppendorf)，5 mL塑料离心管，10 mL塑料离心管(BD)。

1.2.2 试剂与标准溶液

饱和苦味酸溶液^[9] (约15 g/L)；氢氧化钠溶液(100 g/L)；临用时氢氧化钠溶液和饱和苦味酸上清液混合，得到显色液；肌酐标准贮备溶液[ρ(肌酐) = 2.00 g/L]（A）：准确称取0.4000 g肌酐，加入一定量纯净水，加入0.83 mL盐酸，定容至50 mL，此标准溶液在实验室配制；实验用试剂均为分析纯；实验用水为瓶装纯净水。以上试剂均为国药集团化学试剂北京有限公司

1.3 样品来源

在CL乡的5个乡村共有儿童302人，整群抽取儿童作为研究对象，采集儿童及其家长的晨尿共613份作为实验样品进行尿肌酐测定。

1.4 尿样样品的采集

将集尿瓶使用10%硝酸浸泡过液并用蒸馏水洗净（或直接使用纯净水瓶）；负责CL乡现场体检的医生将标有受试者姓名和编码的100 mL尿杯发给受试者^[10]，受试者用尿杯采集晨尿中段尿约80 mL后交给项目负责的检测人员，此尿样采集过程大约需要0.5 h，检测人员登记后立即测定尿肌酐。

1.5 标准曲线的配制

取4支5 mL离心管分别加入200 μL纯水并编号为B，C，D和E管；吸取肌酐标准储备溶液A 200 μL加入到B管中，混匀后吸取200 μL B管中的溶液加入到C管中，混匀后同理吸取200 μL C管中的溶液加入到D管中，混匀；取E，D，C和B管中的溶液以及肌酐标准储备溶液A 40 μL分别加入装有3 mL纯水的10 mL离心管中，配制浓度为0，0.25，0.50，1.00和2.00 g/L的标准系列溶液。

1.6 样品测定

用50 μL移液器，取尿样20.0 μL于10 mL离心管中，用瓶口分配器加入3.02 mL纯水；用1 000 μL移液器向标准系列和尿样中分别加入500 μL显色液X，混匀，放置15 min，于490 nm波长，用1 cm比色皿，以溶液空白校零，测定标准曲线和尿样肌酐含量。

1.7 质量控制

为保证现场检测质量，验证检测数据的合理、有效性，规定肌酐标准储备液在实验室配制完成后带到现场（可常温放置10 d），使用时直接用肌酐标准储备液倍比稀释配制标准系列；显色液X碱性苦味酸）在每批次样品临用时混合配制；样品超出线性范围时，倍比稀释待测样品后重新测定；每批次样品测定现场空白2个且测定不少于10%的平行样，要求相对误差< 10%。

2 结果与讨论 2.1 显色反应条件

2.1.1 显色反应时间的选择

实验结果表明，现场测定环境的温度对显色反应时间有一定影响，显色反应时间随着温度的升高而缩短，因此可根据现场环境的不同适当调整显色反应时间。温度与显色反应时间的关系如表 1。

2.1.2 显色剂用量的选择

配制浓度为0g/L，0.25 g/L，0.50 g/L，1.00 g/L和2.00 g/L的标准系列溶液，在实验条件下，分别加入显色液X 100 μL，200 μL，500 μL和1 000 μL；测定各标准浓度点的吸光度。显色液X (碱性苦味酸)的加入量在500 μL以上时，体系吸光度值最大且稳定。本实验选择显色液X(碱性苦味酸)用量是500 μL(表 2)。

2.1.3 显色体系的稳定性

配制浓度为0 g/L，0.25 g/L，0.50 g/L，1.00 g/L和2.00 g/L的标准系列溶液，在实验条件下，分别在10 min，15 min，30 min，60 min，120 min和300 min时测定各标准浓度点吸光度。本反应在常温下即可顺利进行，加入显色液X(碱性苦味酸)15 min后，体系的吸光度达到最大，在15 min～300 min内基本不变，因此在CL乡现场测定时选择显色15 min后进行测定（表 3）。

2.2 线性范围和检出限

尿肌酐在0 ~ 2.00 g/L范围内呈良好的线性关系，相关系数r = 0.9998，重复测定6次，以吸光度为0.010时对应的浓度为检出限，求得检出限为0.005 g/L。通过计算得本方法的检出限为0.01 g/L（表 4）。

2.3 精密度和回收率

取一尿样样品进行加标回收实验，分别加入低、中和高三个浓度水平的标准溶液，加标溶液浓度分别为0.20 g/L，0.50 g/L和1.00 g/L，计算加标测定的平均回收率，同一样品平行测定6次，计算6次测定的相对标准偏差（表 5）。结果表明，低、中、高三个浓度水平的样品平均回收率98.6% ~ 99.6%，精密度1.6% ~ 2.5%。

2.4 现场空白测定结果

由于现场测定环境不一，在实验中很可能引入污染，因此测定现场空白十分必要。将空集尿杯加入100 mL纯水，用振荡器振荡5 min，按样品测定方法同步处理，以纯水试剂空白溶液校零，测定其吸光度，10批次现场空白样品测定结果均小于0.005 g/L。

2.5 平行样相对误差测定结果

每批次样品测定平行样，平行样相对误差均小于10%（表 6）。

2.6 苦味酸分光光度法现场快速测定法与国标分光光度法测定尿肌酐值得显著性检验

将本实验方法与《尿中肌酐分光光度测定方法》（WS/T 97-1996）^[9]测定的30组尿肌酐，经显著性检验，(P=0.005, P<0.05)，说明两种方法差异无统计学意义。

2.7 尿肌酐快速测定方法应用

在CL乡P村、I村、J村、H村和B村（包括儿童和儿童家长）共613人现场收集其尿样进行尿肌酐测定（表 7）。

3 小结

取尿样20.0 μL于10 mL离心管中，用瓶口分配器加入3.02 mL纯水，再加入500 μL碱性苦味酸显色液，于490 nm波长，以空白溶液校零，测定尿样肌酐含量，不仅灵敏度高而且免去行标中繁琐的溶液配制过程，使得整个测定过程迅速、经济和准确。，本实验方法低、中、高三个浓度水平的平均加标回收率98.6% ~ 99.6%，RSD为1.6% ~ 2.5%，平行样测定相对误差0.3% ~ 4.2%，适用于现场尿中肌酐的测定。在测定的613份尿样样品中，儿童的尿肌酐测定结果为0.08 g/L ~ 2.57 g/L，偏离正常值 的百分比率为2.0%，成人的尿肌酐测定结果为0.16 g/L ~ 4.44 g/L，偏离正常值的百分比率为3.5%。尿肌酐偏离正常值范围归根到底是肾脏损伤的早期阶段，可能是由于身体疲劳、生活细节不注意引起的，对于尿肌酐超出正常值范围的人群应引起关注，并结合血中肌酐的结果进一步分析偏离正常值的原因。值得指出的是，在体检现场测定尿肌酐，质量控制工作尤为重要。由于受试者的教育程度、文化背景不同，在采集尿样时，项目负责人要对尿样的采集要求进行严格、统一的规定，对受试者进行耐心的讲解、指导，这样有利于所采集样品的一致性。由于现场测试环境不同，要考虑实验用水以及废弃物、废液的处理，以免对测定环境造成污染。