2. 江苏省常州市疾病预防控制中心;
3. 江苏省无锡市疾病预防控制中心
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LIU Fan
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我国公共场所发展迅速，因其具有人群高度密集、流动性大、健康和非健康个体混杂的特点，是空气传播性疾病的易发地[1-2]。嗜肺军团菌是公共场所常见病原菌，其扩散传播并感染人体的主要途径是空气传播，然而由于空气中微生物浓度极低，现有采样技术和检测方法仍存在一定局限，使得空气嗜肺军团菌污染水平与人群嗜肺军团菌感染率关系数据缺乏，限制了嗜肺军团菌人群暴露—感染关系研究进展[3-4]。本研究以宾馆饭店和商场超市两类公共场所为研究现场，荧光定量PCR法检测公共场所空气中嗜肺军团菌污染水平，ELISA法调查从业人员嗜肺军团菌感染现况，分析公共场所空气中嗜肺军团菌污染和人群感染率关系，为公共场所嗜肺军团菌人群感染风险评价模型和早期预警技术的发展提供数据支持。
1 材料与方法 1.1 仪器与试剂虚拟冲击式浓缩器(中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所)；BioSampler液体冲击式采样器(美国SKC公司)；3-18K型冷冻离心机(德国SIGMA公司)；ABI 7500荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；Varioskan Flash全波长扫描式多功能酶标仪(美国Thermo Scientific公司)；WELLWASH 4 MK 2洗板机(美国Thermo Scientific公司)。
E.Z.N.A.TM Bacterial DNA Kit(美国OMEGA公司)；RealMaster Mix(Probe)荧光定量PCR反应体系(北京天根公司)；Minicon B15浓缩器(德国默克密理博 公司)；嗜肺军团菌尿抗原ELISA检测试剂盒EIA-4205(德国DRG公司)；嗜肺军团菌血清IgG/IgM/IgA抗体ELISA检测试剂盒1651-2Z(美国DA公司)；嗜肺军团菌Ⅰ型ATCC 33152菌株(美国疾病预防控制中心)；金黄色葡萄球菌ATCC 6538菌株(美国疾病预防控制中心)；嗜肺军团菌质粒标准品(上海闪晶分子生物科技有限公司)。本实验引物和探针由上海生物工程技术有限公司合成。
1.2 空气样品采集于2013年和2014年7月—8月，随机选择江苏省常州市和无锡市宾馆饭店和商场超市共7家场所为研究现场，采用虚拟冲击式浓缩器联合BioSampler生物冲击式采样器，采集空气样品，采样点距地面垂直距离为1.5 m，采样流量为120 L/min，采样时间15 min，采样吸收液为1.2%酵母浸出液。
1.3 人群生物样品采集在2013年和2014年7月—8月，与空气样品采集同步进行公共场所从业人员尿和血样品采集。调查对象入选标准：①签署知情同意书，自愿参加本调查；②年龄不低于22岁，男女不限；③场所集中空调系统维护人员原则上应作为调查对象。调查对象排除标准：①迎宾、保安等室外工作人员和厨师；②妊娠期或哺乳期妇女；③因故无法配合问卷调查与体检的工作人员。入选调查人群能够代表该场所空气嗜肺军团菌暴露人群。采集从业人员尿样本6 mL，静脉血标本3 mL，均置于灭菌离心管内，血标本37℃温箱孵育60 min，3 000 r/min，10 min，分离血清。所有生物样本-70℃保存。
1.4 空气中嗜肺军团菌检测采样吸收液3 500 r/min离心30 min，留3 mL沉淀，E.Z.N.A.TM Bacterial DNA Kit试剂盒制备DNA模板。采用基于TaqMan探针法的荧光定量PCR法定量检测空气中嗜肺军团菌浓度[5]，上游引物5’-GAAAATAAAGTAAAAGGGGAAGCC -3’； 下游引物5’-ATCAATCAGACGACCAGTGT-ATTC-3’； 探针5’-FAM-AGGCGTTGTTGTATTGCCAAGTGGTT-TAMRA-3’。PCR反应体系包括：2×RealMaster Mix反应体系基础10 μL，20×Probe Enhance Solution 探针增 强溶液1.25 μL，上游和下游引物各1.25 μL(10 μmol/L)，探针0.625 μL (10 μmol/L)，模板5 μL，去离子水补足25 μL。扩增条件：94℃预变性4 min，94℃变性20 s，60℃退火并延伸60 s，61 s检测荧光信号，进行40个循环，每个样品三个复孔。以无核酸酶的去离子水为空白对照，嗜肺军团菌Ⅰ型ATCC 33152菌株为阳性对照，金黄色葡萄球菌ATCC 6538菌株为阴性对照。
1.5 尿嗜肺军团菌抗原ELISA检测尿样本5 mL经Minicon B15静态浓缩器处理，嗜肺军团菌尿抗原试剂盒检测浓缩尿中的嗜肺军团菌抗原。每次检测设阴性控制和阳性控制。450 nm波长吸光度减去630 nm波长吸光度为检测孔样品的吸光度。质控要求为：阴性控制吸光度<0.15 OD，阳性控制吸光度>0.5 OD。吸光度<0.15 OD则为阴性，吸光度≥0.15OD为阳性。
1.6 血清嗜肺军团菌抗体ELISA检测采用血清嗜肺军团菌抗体试剂盒检测血清中嗜肺军团菌1～6血清型的IgG/IgA/IgM总抗体。每次检测包括空白对照、阳性和阴性控制各1孔，校准3孔。450 nm波长下检测孔吸光度，样品OD比=样品OD值/(校正系数×校准剂OD均值)。质控要求为：阴性控制OD值≤0.250；阳性控制OD值≥ 0.500；校准孔OD均值≥ 0.300；阴性控制OD值/校准孔OD均值≤0.9；阳性控制OD值/校准孔OD均值≥ 1.25。OD比≤0.90为阴性，OD比在0.91～1.09间为疑似，OD比≥ 1.10为阳性，疑似样品复测后判定结果。
1.7 数据分析荧光定量PCR 检测结果采用ABl 7 500 System SDS Software1.4 进行处理分析。公共场所从业人员嗜肺军团菌尿抗原或血清抗体检测任一阳性即为嗜肺军团菌感染。采用SPSS 16.0进行统计学分析，空气中嗜肺军团菌浓度与从业人员嗜肺军团菌感染率相关性采用Spearman秩相关分析，检验水准α为0.05。
2 结果 2.1 公共场所空气中嗜肺军团菌污染水平共调查公共场所7家，其中常州市3家，无锡市4家。采集场所空气样本70份，嗜肺军团菌阳性率30.0%(21/70)，其中常州和无锡市公共场所空气中嗜肺军团菌阳性率分别为50.0%(15/30)和15.0%(6/40)。共获得有效浓度数据29个，每个场所室内空气中嗜肺军团菌浓度均值见表 1。经卡方检验，不同城市间公共场所空气中嗜肺军团菌阳性率差异有统计学意义(χ2=10.000，P=0.002)；不同公共场所间空气中嗜肺军团菌阳性率差异有统计学意义(χ2=13.213，P=0.031)。
| 场所名称 | 样本量 | 阳性数 | 阳性率/% | 浓度均值/(copies/m3) |
| CZ-1 | 10 | 6 | 60.0% | 1 206 |
| CZ-2 | 10 | 4 | 40.0% | 662 |
| CZ-3 | 10 | 5 | 50.0% | 613 |
| WX-1 | 10 | 2 | 20.0% | 374 |
| WX-2 | 10 | 1 | 10.0% | 75 |
| WX-3 | 10 | 0 | 0 | 0 |
| WX-4 | 10 | 3 | 30.0% | 256 |
2.2 从业人员嗜肺军团菌感染现况
共调查上述7家公共场所从业人员280名，嗜肺军团菌感染率40.7%(114/280)，其中常州和无锡市公共场所从业人员嗜肺军团菌感染率分别为72.3%(86/119)和17.4%(28/161)，每个场所从业人员嗜肺军团菌感染率见表 2。经卡方检验，不同城市间从业人员嗜肺军团菌感染率差异有统计学意义(χ2 =85.371，P=0.000)；不同场所间从业人员嗜肺军团菌感染率差异有统计学意义(χ2 =91.471，P=0.000)。
| 场所名称 | 样本量 | 阳性数 | 感染率/% |
| CZ-1 | 28 | 19 | 67.9 |
| CZ-2 | 26 | 22 | 84.6 |
| CZ-3 | 65 | 45 | 69.2 |
| WX-1 | 40 | 7 | 17.5 |
| WX-2 | 42 | 6 | 14.3 |
| WX-3 | 38 | 3 | 7.9 |
| WX-4 | 41 | 12 | 29.3 |
2.3 空气中嗜肺军团菌与人群感染相关性
公共场所空气中嗜肺军团菌浓度与从业人员感染率关系见图 1，经Spearman秩相关分析，相关系数为0.857，P=0.014，公共场所空气中嗜肺军团菌浓度与从业人员感染率之间的相关性有统计学意义。
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| 图 1 不同公共场所空气中嗜肺军团菌浓度和从业人员感染率的关系 |
3 讨论
嗜肺军团菌是一种广泛存在于公共场所环境中的兼性胞内革兰氏阴性杆菌，主要通过空气方式扩散传播并感染人体，引起军团菌病散发或爆发[4-6]。军团菌病包括军团病和庞蒂亚克热，庞蒂亚克热以流感样症状为主要表现，军团病是以肺炎为主要表现，病死率在5%～40%之间，世界范围内军团病时有发生。我国尚无军团菌病监测报告系统，医院对军团菌病的病原学诊断较少，同时由于军团菌病诊断复杂，我国军团菌病发病和患病数据匮乏，流行病学研究较少，使得人群嗜肺军团菌健康风险评价和早期预警技术研究受到限制[7]。
公共场所空气中嗜肺军团菌具有来源复杂、活性多变、沉积再生、扩散广泛以及感染多样的特征，易发于人群密集的公共场所，常以低浓度状态存在于空气中，培养法虽是军团菌检测的标准方法，但其对培养基要求高、培养周期长，易受杂菌生长的影响，特别是空气中军团菌以低浓度状态存在以及采样技术局限，容易出现假阴性结果[8]。荧光定量PCR法在一定程度上克服了培养法的局限，虽然其不能区分军团菌的存活状态，但检出限较低、检测时间较短且能获得定量数据，为空气中军团菌污染研究提供了快速的检测手段[9]。本研究以宾馆饭店、商场超市两类典型公共场所为研究现场，同时检测空气中嗜肺军团菌浓度和从业人员嗜肺军团菌感染率并探讨两者质量相关性。
7家公共场所空气中嗜肺军团菌阳性率30.0%，常州市3家公共场所空气中嗜肺军团菌阳性率(50.0%)远高于无锡市4家公共场所(15.0%)，CZ-1场所空气中嗜肺军团菌阳性率(60.0%)和浓度(1 206 copies/mL)最高。不同城市和不同场所间空气中嗜肺军团菌阳性率差异均有统计学意义，在环境调查同时，对上述7家公共场所280名从业人员开展嗜肺军团菌感染现况调查，感染率为40.4%，常州市被调查公共场所从业人员嗜肺军团菌感染率(71.4%)远高于无锡市(17.4%)，不同城市和不同场所间从业人员嗜肺军团菌感染率差异有统计学意义，这与空气中嗜肺军团菌的调查结果呈现一致的趋势。
人体嗜肺军团菌感染调查方法包括痰中嗜肺军团菌、血清抗体和尿抗原检测，本研究以从业人员为研究对象，血清抗体或尿抗原任一阳性即为嗜肺军团菌感染，能够在一定程度降低假阴性结果提高阳性检出率。在对同一场所空气中嗜肺军团菌浓度和人群感染率Spearman秩相关分析显示，两者之间相关性有统计学意义(r=0.857，P=0.014)，说明空气作为嗜肺军团菌扩散传播的关键环节，与人群感染密切相关，这为嗜肺军团菌暴露—感染关系的研究提供了方法支持。本次研究仅选择7家公共场所，采集70份空气样本和280名从业人员进行分析，虽然两者之间相关性有统计学意义，但建立有代表性的公共场所嗜肺军团菌暴露—感染关系仍需扩大样本量并开展进一步调查研究。
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