慢性氟中毒引起的氟性骨损伤(fluoride bone injure，FBI)是由于机体长期摄入过量氟而干扰骨组织骨转换过程，引起的以骨代谢紊乱为主要病理特征的慢性代谢性骨病^[1]。氟性骨病表现形式复杂多样，可出现骨软化、骨硬化、骨质疏松、异位骨化及软骨和关节的退行性改变^[2]。对氟中毒的研究中，学者们研究发现氟骨症的骨硬化主要是由于骨转换加速，成骨活性增强的结果；氟骨症的骨质疏松属于骨转换加速的活动性骨质疏松^[3]。可采用成骨细胞与破骨细胞分泌的酶来评价骨转换过程^[4]。本研究应用骨形态计量学法、血清骨代谢标志物Elisa检测法，探讨NaF对SD大鼠骨组织病理、骨代谢标志物的影响以及两者之间是否存在一定关联。

1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器

CSB-F-2型春花牌复合氟电极、春花牌微容池(长沙益天实验仪器有限公司春花制作中心)；雷磁牌PHS-3C型PH计(上海精密科学仪器有限公司)；GZX-9246 MBE数显鼓风干燥箱(上海博迅实业医疗设备厂)；4-10箱式电阻炉(上海路达实验仪器有限公司)；比色管；坩埚；MULTISKAN GO型超级酶标仪(美国Thermo Scientific公司)；DNX-9620G洗板机(北京普朗新技术有限公司)；Biomias2001彩色图像分析系统(四川大学图象图形研究所)；NaF(assay≥99％，美国Sigma-Aldrich公司)，NaF染毒溶液的配制：准确称取适量的NaF溶于自来水(氟离子浓度为0.321 mg/L)中，配制成50 mg/L、150 mg/L和250 mg/L的NaF溶液(氟离子浓度分别为22.62 mg/L、67.86 mg/L和113.11 mg/L)。

NaF(纯度≥99%，美国Sigma-Aldrich公司)；3 mol/L盐酸；溴甲酚绿指示剂；2%NaOH；离子强度调节缓冲溶液TISAB；10%福尔马林；10%EDTA-2Na；0.5%伊红染液；大鼠酶联免疫分析试剂盒(美国TSZ生物公司)：骨钙素(BGP)、骨碱性磷酸酶(BALP)、Ⅰ型原胶原N端肽(PⅠNP)、Ⅰ型胶原交联C-末端肽(CTX-Ⅰ)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)。

1.2 实验动物及分组

选取断乳2周，体重为110 g～140 g的清洁级SD大鼠48只(由贵州医科大学动物实验中心提供)，许可证编号为SCXK(军)2012-0011，实验动物伦理编号为：1312024；实验动物房清洁级，温度为26.5℃，相对湿度为60%，工作照度为278 lx，(实验动物房许可证编号为SYXK(黔)2012-0001)。实验动物适应性饲养1周后，按体重均衡随机化分组的方法分为4个组，每组12只，雌、雄各半，设对照组，低、中、高剂量组，分笼饲养。根据氟化钠的大鼠经口LD₅₀为147.5 mg/kg，及慢性毒性实验的染毒剂量取值范围^[5]即1/5 LD₅₀、1/10 LD₅₀、1/20 LD₅₀，又据成年大鼠的日饮水量为27 mL～54 mL，设置低、中、高三个剂量组的饮水NaF浓度为50 mg/L、150 mg/L、250 mg/L，对照组饮自来水(氟离子浓度为0.321 mg/L)；饲以由贵州医科大学实验动物中心配制的标准固体饲料(含氟量＜0.5 mg/kg)。各组大鼠均自由饮水、摄食。喂养6个月，期间观察动物的一般情况并记录，定时监测尿氟、氟斑牙情况。6个月后，经乙醚麻醉，股动脉放血处死大鼠，收集血清、四肢骨。

1.3 观察指标及检测方法

1.3.1 氟斑牙的鉴定

在充足光线下，暴露大鼠口腔，用数码相机拍摄大鼠牙齿正位片釉质变化情况，氟斑牙诊断按以下标准^[6]：0级：正常鼠牙釉质，牙面桔黄或棕色，呈半透明；Ⅰ级：牙面横向出现细小规则的棕白色相间横纹；Ⅱ级：不规则棕、白色相间横纹，横纹间白垩部分渐变宽，棕纹在某些区域中断，但仍多于50%的牙面；Ⅲ级：白垩区域更多，而不规则棕色橫纹少于50%的牙面并且牙面有微小的独立的窝状缺损，但牙形态无明显改变；Ⅳ级：整个牙面呈白垩粉笔样改变，牙缘常断缺。氟斑牙检出率为Ⅰ-Ⅳ级氟斑牙的总检出只数与所在组别大鼠总数的比值。

1.3.2 尿氟测定

处死前一周，将实验大鼠置于代谢笼，禁食禁水，收集12 h尿，按照《尿中氟的离子选择电极测定方法》(WS/T 30-1996)^[7]测定尿氟含量。方法的检出限为0.1 mg/L，尿样加标回收率为96.5%～102.5%，变异系数为0.5%～3.7%。

1.3.3 骨氟测定

收集大鼠左上肢尺桡骨，剔去肌肉、结缔组织，采用灰化—氟离子电极法测定骨组织中氟的含量。于80℃烘干6 h，250℃炭化至不冒烟，650℃灰化2 h后，称取100 mg骨粉于比色管中，用3 mL盐酸溶解，加1滴溴甲酚绿指示剂，用2%NaOH调节pH值至淡蓝色，定容至20 mL，取2 mL样品上清液，加8 mL去离子水，离子强度调节缓冲溶液10 mL于50 mL一次性杯中，置入复合氟离子选择电极，待电位平衡后，读取电位值，以电位值为纵坐标，以氟离子含量对数为横坐标，绘制标准曲线。然后通过标准曲线方程计算得出100 mg骨粉样品氟的含量进而得出1 mg骨粉样品氟的含量，换算为单位mg/kg。方法的检出限为1.25 mg/kg，加标回收率为93.3%～101.3%，变异系数为0.5%～3.3%。

1.3.4 血氟测定

取大鼠股动脉血，4 500 r/min、4℃离心10 min，收集血清分装后于-80℃冻存备用。按照《血清中氟化物的测定 离子选择电极法》(WS/T 212-2001)^[8]测定血氟含量。

1.3.5 氟中毒大鼠骨组织形态计量学参数测定

取大鼠右下肢股骨远端1/3置于10%中性福尔马林溶液中固定72 h后，10%的乙二胺四乙酸二钠(pH=7.4)脱钙五周至大头针能无阻力地穿过骨组织，期间每72 h更换脱钙液一次，以10%中性福尔马林溶液中止脱钙，常规石蜡包埋，制作3 μm石蜡切片后苏木精—伊红(HE)染色，在LONYPAS HB51型光学显微镜下，观察骨组织形态学变化。通过SONY摄像头在HE切片中采集骨皮质、骨小梁、成骨细胞图象并输入本图象分析系统，三个指标各在每例HE切片中选取5个视场，用鼠标分割系统自测量法测量骨皮质平均厚度、骨小梁平均面积，用鼠标点击系统自动计数法计数成骨细胞，成骨细胞计量部位为骨皮质。

1.3.6 血清骨代谢标志物测定

大鼠股动脉血离心后取上层血清，采用ELISA方法检测BGP、BALP、PⅠNP、CTX-Ⅰ、TRACP-5b含量，方法严格按照酶联免疫分析试剂盒(96孔)说明书。设空白孔、标准孔、待测样品孔，且分别做一个重复孔，合计92孔，故雌、雄各组6只大鼠均随机选取5个样本检测。空白孔加入50 μL样品稀释液，标准孔各加入1~5号)标准品50 μL，待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，然后再加待测血清10 μL。在37℃温育30 min，洗板机洗板5次，加入酶标试剂50 μL，空白孔除外。洗板机洗板5次，加入显色液A与B各50 μL后37℃避光显色10 min，加入终止液50 μL终止反应。于450 nm波长读取吸光度值，以测定OD值减去空白孔值调零得到校正OD值，用标准品的浓度与校正OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的校正OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为血清的BGP、BALP、PⅠNP、CTX-Ⅰ、TRACP-5b实际浓度。

1.3.7 统计学分析

采用SPSS 18.0软件，检验水准α=0.05。计量资料先进行正态性检验后，若符合正态分布，采用单因素方差分析(One Way-ANOVA)；进一步的组间两两比较时，若方差齐时，采用SNK检验；若方差不齐时，采用Games-Howell检验。不符合正态分布的计量资料和计数资料的组间比较采用Kruskal-Wallis H秩和检验。

染氟期间，对照组雌鼠、低氟组雄鼠各意外死亡1只，全程均未纳入数据统计。

2 结果 2.1 实验期间大鼠的基本特征及体重变化

NaF染毒6个月期间，各组大鼠进食饮水较好，精神状态无异常，体重逐渐增加。实验进程中监测大鼠的体重变化，结果显示50 mg/L、150 mg/L、250 mg/L染氟对雌鼠体重影响不显著；50 mg/L、150 mg/L染氟对雄鼠体重影响不显著，250 mg/L NaF染氟对雄鼠体重影响显著(P＜0.05)，并且染氟1个月起高氟组雄鼠体重增幅均小于对照组、低氟组、中氟组雄鼠(表 1，表 2)。

2.2 染氟大鼠氟斑牙检出率、尿氟、骨氟、血清氟含量

由表 3，表 4可见，投氟6个月后，各染氟组大鼠氟斑牙检出率、尿氟、骨氟和血清氟含量均高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，而且随染氟剂量增高，氟斑牙严重程度、尿氟、骨氟和血清氟呈上升趋势。

2.3 染氟大鼠股骨形态计量学参数测定结果

由表 5可见，中高氟组雌雄大鼠的骨皮质厚度均高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，中、高氟组雄鼠骨小梁面积大于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；低氟组雌雄鼠骨小梁平均面积均小于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；低、中、高氟组雌雄成骨细胞数均低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.4 各组大鼠血清骨代谢标志物检测结果

由表 6，表 7可见，血清BGP、BALP、PⅠNP三个指标的表达：低、中、高氟组雌雄鼠BGP、BALP、PⅠNP均小于对照组，差异多有统计学意义(P_中雌BGP=0.009，P_中雌BGP=0.008；P_中雌BALP=0.009，P_中雌BALP=0.003；P_中雌BALP=0.038，P_中雄BALP=0.000，P_高雄BALP=0.000；P低雌PⅠNP=0.002，P_中雌PⅠNP=0.006，P_中雌PⅠNP=0.003；P_中雌PⅠNP=0.019，P_中雄PⅠNP=0.028，P_高雄PⅠNP=0.042)。血清CTX-Ⅰ、TRACP-5b两个指标的表达：低中高氟组雌雄鼠CTX-Ⅰ、TRACP-5b均小于对照组，差异多有统计学意义(P_低雌CTX-Ⅰ=0.032，P_高雌CTX-Ⅰ=0.041；P_低雄CTX-Ⅰ=0.000，P_中雄CTX-Ⅰ=0.000，P_高雄CTX-Ⅰ=0.000；P_中雌TRACP-5b=0.033，P_高雌TRACP-5b=0.028；P_低雄TRACP-5b=0.044，P_中雄TRACP-5b=0.008，P_高雄TRACP-5b=0.006)。

3 讨论

本研究对SD大鼠染氟6个月结果显示，各剂量组大鼠尿氟、骨氟和血氟均高于对照组，氟斑牙发生率均为100%，对照组无氟斑牙发生。上述各指标，染氟剂量高的组别高于或严重于染毒剂量低的组别，说明大鼠慢性氟中毒模型复制成功。

骨转换即成骨细胞形成类骨质并矿化和破骨细胞清除旧骨的过程，骨形成总量超过骨吸收的总量则导致异常新骨的形成；骨吸收总量超过骨形成总量，造成骨量丢失，临床上常见的表现为骨质疏松^[9]。骨转换异常是氟性骨损伤多种病变的共同特征。骨形成是一个动态积累的过程，成骨细胞合成并分泌骨胶原，形成骨基质并使其钙化来完成骨形成过程。破骨细胞分泌酸性物质与蛋白酶降解骨基质来完成破骨作用。成骨与破骨贯穿骨代谢的始终，成骨细胞与破骨细胞的动态平衡被破坏将导致骨损伤^[10]。在骨形成过程中，成骨细胞主要经历成骨细胞增殖、细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡四个阶段。成骨细胞增殖期主要增加细胞数量；在成骨细胞增殖晚期，细胞进入分化而成骨细胞特异性的指标蛋白增高；在矿化期，一些指标蛋白活性下降；最后，成骨细胞开始调亡。氟可抑制成骨细胞各期的转换，加速细胞的凋亡^[11]。骨代谢标志物是一类源于骨基质或骨细胞的代谢指标，与骨形成相关的骨代谢标志物有骨碱性磷酸酶(BALP)、骨钙素(BGP)和Ⅰ型前胶原前肽。BGP是成骨细胞在骨基质矿化过程中合成的非胶原蛋白，BALP在成骨细胞的骨形成过程中大量分泌，Ⅰ型前胶原前肽包括Ⅰ型前胶原羧基末端(C端)前肽(PⅠCP)和Ⅰ型前胶原氨基末端(N端)前肽(PⅠNP)。骨基质主要由胶原组成，其中Ⅰ型胶原是骨组织中唯一的胶原，来源于Ⅰ型前胶原，在成骨细胞中合成，分泌到胞外后在特异性酶作用下，去除两端的多肽，形成Ⅰ型胶原并聚合成为胶原纤维，生成PⅠCP和PⅠNP并释放入血。PⅠCP短期内被清除，PⅠNP则可较长时间存在于血液当中，可较稳定地反映骨形成水平^[12]。与骨吸收相关的骨代谢标志物有破骨细胞分泌的Ⅰ型胶原C端肽(CTX-Ⅰ)、Ⅰ型胶原N末端肽(NTX-Ⅰ)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP-5b)。抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)是酸性磷酸酶6种同工酶中的第5型，骨吸收时，TRACP参与骨基质中固体钙磷矿化底物降解。血液循环中的TRACP5有TRACP-5b和TRACP-5a两种形式，血清TRACP-5b水平与激活的破骨细胞数相一致，可被氟化物所抑制^[13]。

骨形态计量学结果显示中高氟组雌雄鼠的骨皮质厚度、中高氟组雄鼠骨小梁面积均大于对照组，表明中高氟组骨量增加；低氟组雌雄鼠骨小梁平均面积均小于对照组，提示骨量减少；低中高氟组雌雄成骨细胞数均低于对照组，与三个染毒组大鼠反映成骨细胞活性的BGP、BALP、PⅠNP较对照组均呈现减少趋势一致。反映破骨细胞活性的CTX-Ⅰ、TRACP-5b均下降。推测染氟6个月这个时间段，较高剂量氟可加速成骨细胞进入矿化期至凋亡期，因而细胞数目与反映细胞活性的指标均下降。骨皮质成骨细胞减少还可能由于成骨细胞分泌骨基质生成骨皮质后，成骨细胞被包埋于基质中，向骨细胞转变^[14-15]，因此骨皮质虽然动态积累增加，成骨细胞自身数目却减少。反映破骨活性的CTX-Ⅰ、TRACP-5b水平下降也可与过量氟抑制破骨细胞活性有关。

在过去的研究中，于燕妮等^[14]发现60 mg/L氟化钠染氟5个月后大鼠骨皮质变薄，骨小梁变细，骨密度降低，与本实验的低氟组病理改变相似。中氟组的病理改变与Yan等^[17]研究发现染氟150 mg/L的大鼠实验4个月后呈现以骨密度增加为主的硬化型改变较为一致。中高氟组出现的反映成骨活性的BGP与BALP水平下降，与Song等^[18]的研究结果10 mg/L、150 mg/L、400 mg/L氟化物诱导大鼠血清BGP、BALP以下降趋势为主相似。体现破骨活性的CTX-Ⅰ、TRACP-5b水平下降反映了一些学者认为的氟中毒骨量增加可能主要不是由于成骨功能增强而是破骨细胞活性减弱和生命周期缩短，强调破骨细胞对氟化物的敏感性较成骨细胞高^[19]。体外细胞研究表明，500 mg/L NaF染氟24 h可显著增加新生大鼠成骨细胞凋亡率^[20]，8 mg/L NaF染毒72 h可使新生破骨细胞增殖与分化受到抑制，表现为活性降低^[21]。大鼠体内实验表明，150 mg/L NaF染毒可诱导成骨细胞显著凋亡^[22]；随着氟作用时间延长，股骨中促进破骨作用的因子RANKL被抑制^[23]。

综上所述，本实验观察到经饮水染氟6个月，反映成骨细胞活性和破骨细胞活性的骨代谢指标在不同剂量组中表现为不同程度下调，骨组织形态计量显示150 mg/L和250 mg/L组大鼠骨量增加；50 mg/L组大鼠则出现骨量减少的指征。提示氟对成骨活性与破骨活性均有影响，且与染氟剂量有关。但本次实验未对大鼠不同染氟期的血清骨代谢标志物进行动态检测，本课题组将在今后的工作中针对氟对成骨活性与破骨活性影响的时间与剂量效应及其调控机制进行深入探讨。