甜蜜素 (环己基氨基磺酸钠，sodium cyclamate) 是一种常用的食品添加剂，根据《食品添加剂使用卫生标准》(GB 2760-2007)[1]的规定，其使用有一定的限定值。目前我国已有的《食品中环己基氨基磺酸钠的测定》(GB/T 5009.97-2003)[2]，存在着实际操作繁琐[3-4]，干扰大，误差大等缺点。超高效液相色谱—联质谱法 (PLC-MS/MS) 具有高灵敏度、选择性强，可以排除液相色谱[6-8]中假阳性的干扰，提高了检测准确度。为准确评定测量结果，本文根据ISO/IEC Guide 98-3：2008《测量不确定度表述指南》[9]和《测量不确定度评定与表示》(JJF 1059.1-2012)[10]，对超高效液相色谱—串联质谱测定饮料中甜蜜素含量的不确定度进行了分析和评定。
1 材料与方法 1.1 仪器Agilent Technologies 1290超高效液相色谱—API 4000串联四级杆质谱仪 (美国AB公司)，配有电喷雾离子源 (ESI)；超纯水发生器 (美国LABCONCO公司)；电子天平 (AG245，德国METTLER公司)；0.22μm PTFE滤膜 (上海安谱)。
1.2 试剂乙腈、甲醇均为色谱纯 (默克公司)；乙酸铵为色谱纯 (克拉马尔公司)，与超纯水配成 (0.02 mol/L) 乙酸铵溶液。甲酸为优级纯 (默克公司)，与超纯水配成 (0.05%，v/v) 甲酸溶液。试验超水 (去离子水，电阻值18.2 Ω) 由超纯水发生器系统制得。甜蜜素标准物质 (10.0 mg/mL，不确定度2%) 购自农业部环境保护科研监测所。
1.3 标准系列配制将甜蜜素标准物质用超纯水分别配制成浓度为0、1、2、5、10、20、50、100和200 μg/L的标准系列。
1.4 样品处理不含二氧化碳的饮料 (冰红茶、苹果汁、鲜橙多等)：不需要处理，直接进行称量，称取均质的样品1 g (精确到0.001 g) 于10 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，通过0.22 μm滤膜后待上机测定。
含二氧化碳的饮料 (可口可乐、芬达等)：称取样品1 g (精确到0.001 g) 于烧杯中，加热去除二氧化碳，冷却后用超纯水定容于10 mL容量瓶中，通过0.22 μm滤膜后待上机测定。
1.5 测定条件 1.5.1 实验室温度在 (20±5)℃，所有试验在此温度下进行。
1.5.2 色谱条件Agilent Eclipse plus C18色谱柱 (2.1 mm×50 mm，1.8 μm)；柱温：40℃；进样量：5 μL；流动相：A为0.02 mol/L乙酸铵溶液，B为乙腈，流速为150 μL/min，等度洗脱程序为：时间0~3 min，15%流动相A，85%流动相B。
1.5.3 质谱条件负离子模式ESI(-)；检测方式为多反应监测 (multiple reaction monitor，MRM)，利用保留时间和质核比值定性。质谱条件具体如下：离子喷射电压 (IS) 电压：-4 500 Ⅴ；离子源温度 (TEM)：650℃；气帘气压力 (CUR)：35 psi；碰撞气 (CAD)：6(mL/min)；雾化气压力 (Gasl)：65 psi；辅助干燥气 (Gas2)：50 psi；入口电压EP：-10 Ⅴ；驻留时间 (dwell time)：200 ms；质谱参数：Q1/Q3(m/z)：177.9/80.0；去簇电压 (DP)：-78 Ⅴ；碰撞能量 (CE)：-35 Ⅴ；碰撞池出口电压 (CXP)：-15 Ⅴ。
2 结果 2.1 建立模型建立被测值计算的数学模型，分析其不确定度可能的来源。本实验中，饮料中甜蜜素含量的最终计算数学模型为：
| $x = \frac{{c \times v}}{{m \times {{10}^3}}}$ |
式中：x—试样中环己基氨基磺酸钠含量，μg/kg；
c—由标准曲线计算得到的上机试样溶液中环己基氨基磺酸钠的含量，μg/mL；
v—试样最终定容体积，mL；
m—试样的取样量，g；
103—单位换算系数。
2.2 不确定度来源分析根据检测方法以及数学模型，不确定度分量主要来源为：样品处理和制备过程中引入的不确定度；重复测定样品引入的不确定度；标准溶液制备引入的不确定度；标准曲线拟合引入的不确定度。
2.3 不确定度分量的评定 2.3.1 标准溶液制备产生的不确定度urel(c) 2.3.1.1 定容时温度影响产生的不确定度在 (20±5)℃下的操作过程中，水的膨胀系数为2.1×10-4/℃，温度效应引起的容量瓶最大相对体积变化为5℃×2.1×10-4/℃=0.00105，采用均匀分布，
| ${u_{rel(T)}} = 2 \times 0.00105/\sqrt 3 = 0.0012$ |
根据标准物质证书可知，甜蜜素标准品不确定度为2%，采用均匀分布，包含因子
| ${U_{rel(std)}} = 2/\sqrt 3 = 0.0012$ |
配制过程中用了A级别1、2和10 mL单标线吸量管，A级别1 mL分度吸量管和A级别100 mL单标线容量瓶。根据JJG 196-2006《常用玻璃量具检定规程》[11]，可知其最大允许误差，均匀分布，
| 玻璃器具 | 最大允许误差/mL | 使用次数 | 标准不确定度u/mL | 相对标准不确定度urel |
| 1 mL单标线吸量管 | ±0.007 | 2 | 0.008082 | urel(1)=0.008082 |
| 2 mL单标线吸量管 | ±0.010 | 1 | 0.005774 | urel(2)=0.002887 |
| 10 mL单标线吸量管 | ±0.020 | 2 | 0.022914 | urel(3)=0.002291 |
| 1 mL分度吸量管 | ±0.008 | 7 | 0.032333 | urel(4)=0.032333 |
| 100 mL单标线容量瓶 | ±0.10 | 2 | 0.115470 | urel(5)=0.001154 |
由表 1可得，配制中玻璃量具校准产生的合成相对标准不确定度：
| ${u_{rel(v)}} = \sqrt {u_{_{rel(1)}}^2 + u_{_{rel(2)}}^2 + u_{_{rel(3)}}^2 + u_{_{rel(4)}}^2 + u_{_{rel(5)}}^2} = 0.0336$ |
| ${u_{rel(c)}} = \sqrt {u_{_{rel(T)}}^2 + u_{_{rel(std)}}^2 + u_{_{rel(v)}}^2} = 0.0357$ |
分别配制标准品浓度为0、1、2、5、10、20、50、100和200 μg/mL，分别测定得其对应的峰面积ym，测得结果见表 2，以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制成标准曲线为y=5 438.7484x+733.3088，其线性拟合度为0.9990。
样品进行重复测量6次的平均值为10.56 μg/mL, 根据样品前处理过程的定容体积和称样量换算得到样品中甜蜜素含量为0.105 6 μg/kg。
根据表 2，拟合曲线的剩余标准差为：
| $s(y) = \sqrt {\frac{{\sum\limits_{m = 1}^n {{{(ym - yi)}^2}} }}{{n - 2}}} = 290 00$ |
| 序号 | 标准浓度xi | 响应值ym | 计算值yi | (ym-yi)2 | (xi- |
| 1 | 0 | 7.333×102 | 7.333×102 | 0 | 1.838×103 |
| 2 | 1 | 6.386×103 | 6.172×103 | 4.580×104 | 1.773×103 |
| 3 | 2 | 1.111×104 | 1.161×104 | 2.500×105 | 1.690×103 |
| 4 | 5 | 2.932×104 | 2.793×104 | 1.932×106 | 1.452×103 |
| 5 | 10 | 5.463×104 | 5.512×104 | 2.401×105 | 1.096×103 |
| 6 | 20 | 1.166×105 | 1.095×105 | 5.041×107 | 5.341×102 |
| 7 | 50 | 2.714×105 | 2.727×105 | 1.690×106 | 4.746×101 |
| 8 | 100 | 5.302×105 | 5.446×105 | 2.073×108 | 3.236×103 |
| 9 | 200 | 1.013×106 | 1.088×106 | 5.625×109 | 2.461×104 |
| n=9 | - | ∑=5.887×109 | ∑=3.628×104 |
拟合曲线得到甜蜜素浓度时产生的标准不确定度为：
| $u(x) = \frac{{s(y)}}{b}\sqrt {\frac{1}{p} + \frac{1}{n} + \frac{{{{(x0 - \overline x )}^2}}}{{\sum\limits_{i = 1}^n {{{(xi - \overline x )}^2}} }}} = 2.9540$ |
拟合曲线得到甜蜜素浓度时产生的相对标准不确定度为：
| ${u_{rel(x)}} = \frac{{u(x)}}{{x0}} = 0.2797$ |
其中：ym—标准溶液的实测峰面积；
yi—用校正曲线计算得到的标准溶液的理论峰面积；
b—校正曲线的斜率；
p—样品溶液重复测量次数，p=6；
n—标准溶液的重复测量次数，n=9；
x0—样品处理液中甜蜜素的平均浓度，10.561 μg/mL；
xi—系列标准溶液的浓度，μg/mL。
2.3.3 样品制备产生的不确定度urel(y) 2.3.3.1 称量产生的不确定度电子天平检定证书表明，其最大允许误差为±0.1 mg，均匀分布，
| ${u_{(m)}} = \frac{{0.0001}}{{\sqrt 3 }} = 5.8 \times 10 - 5g$ |
样品的称样量为1.0000 g，则相对标准不确定度为：
| ${u_{rel(m)}} = \frac{{5.8 \times 10 - 5}}{{1.0000}} = 5.8 \times 10 - 5$ |
在样品处理过程中需要使用10 mL的A级单标线容量瓶，根据JJG 196-2006《常用玻璃量具检定规程》[11]，可知其最大允许误差±0.020，均匀分布，
在 (20±5)℃下操作，均匀分布，
| ${u_{rel(2)}} = 0.00105/\sqrt 3 = 0.006$ |
样品处理过程中量器校准产生的相对合成不确定度为：
| ${u_{rel(v)}} = \sqrt {{u^2}rel(1) + {u^2}rel(2)} = 0.0013$ |
| ${u_{rel(y)}} = \sqrt {{u^2}rel(m) + {u^2}rel(v)} = 0.0013$ |
根据工作曲线，以加标试验中10 μg/mL浓度的加标样品进行重复测定，得峰面积依次为20 908.3、20 922.5、22887.1、21 055.4、21 047.8和20 799.9，则其平均峰面积 (
| ${u_{(s)}} = \frac{{SD}}{{\sqrt n }} = 40.2533$ |
其相对标准不确定度为：
| ${u_{rel(s)}} = \frac{{u(s)}}{{{{\overline x }_样}}} = 0.001923$ |
根据仪器检定证书提供信息，仪器测量重复性RSD为2.6%，属于A类评定。则仪器产生的相对标准不确定度为：
| ${u_{rel(仪器)}} = \frac{{{\rm{RSD}}}}{{\sqrt n }} = 0.0106$ |
| ${u_{rel(s样)}} = \sqrt {{u^2}rel(s) + {u^2}rel(仪器)} = 0.0108$ |
饮料中甜蜜素含量测定的相对标准不确定度各分量列于表 3，其中各不确定度分量相互独立，互不关联。
| 不确定度来源 | 类型 | 分量 | 相对标准不确定度 |
| 标准溶液 | B | urel(c) | 0.0357 |
| 标准曲线拟合 | A | urel(x) | 0.2797 |
| 样品制备 | B | urel(y) | 0.0013 |
| 重复性 | B | urel(s样) | 0.0108 |
由表 3可以得到合成标准不确定度为：
| ${U_{(x)}} = \sqrt {u_{rel(c)}^2 + u_{rel(x)}^2 + u_{rel(y)}^2 + u_{rel(s样)}^2} = 0.2822$ |
在上述中可以得知样品中甜蜜素含量为0.1056 μg/kg。则当样品中甜蜜素含量为0.1056 μg/kg时，合成不确定度为 Uc(ω) =0.1056×0.2822=0.0298 μg/kg。取包含因子为2，置信概率为95%，则扩展不确定度为：
| ${U_{(\omega )}} = 2 \times {U_{c(\omega )}} = 0.06{\rm{\mu }}g/kg$ |
该饮料样品中甜蜜素含量为 (0.11±0.06) μg/kg (k=2)。
3 讨论通过对饮料中甜蜜素含量的测定分析，发现各因素引入的不确定度量各不相同。影响测量不确定度的主要来源是标准曲线拟合和残差引入的不确定度，其次是标准样品浓度和测量重复性引入的不确定度，样品制备对不确定度影响不大。标准曲线拟合和残差引入的不确定度较大可能原因有：①仪器在使用前未进行校正；②仪器的检定过期后未检；③仪器运行状态出现异常 (停电等引起)；④操作者在进行检测前未检查仪器状态；⑤检测过程中操作不当等；⑥该方法不适用于目标物检测。对于标准样品浓度和测量重复性所引起的不确定度可能原因是：①玻璃器皿使用引起的；②购买标准品的质量；③仪器本身的重现性等。
对于上述问题，解决办法有：①应加强对实验仪器的维护和保养，按时进行校准，保持其状态的稳定；②操作过程中应严格按照仪器检测步骤进行，检测前应对仪器进行必要的检查和校正；③对方法的适用性进行验证，与其他检测方法进行比较；④要严格控制好标准溶液的配制过程，在使用玻璃仪器时要按照其使用温度操作，减少使用次数；⑤标准品的购置要通过正规程序购买；⑥购买质控样品进行检测，验证仪器准确性；⑦加强实验过程的质量控制，对操作人员要进行标准操作培训，减少人为因素对实验的影响等，从而减少曲线拟合残差带来的不确定度。本实验中曲线拟合残差产生较大不确定度的原因，经过排查得出，可能是由于电力系统问题导致仪器夜间停电，在检测前未进行必要的仪器校准工作，产生较大干扰。在以后工作中应严格按照操作规范进行检测。
| [1] | 原中华人民共和国卫生部. GB 2760-2007食品添加剂使用卫生标准[S]. 北京: 中国标准出版社, 2007. |
| [2] | 原中华人民共和国卫生部. GB/T5009. 97-2003食品中环己基氨基磺酸钠的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2003. |
| [3] | 符展明, 张极星. 顶空气相色谱法测定饮料中的甜蜜素[J]. 中华预防医学杂志, 1994, 28(6): 365–366. |
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| [8] | 尹艳春, 李智红. 反相高效液相色谱法同时测定食品中甜蜜素、糖精钠和苯甲酸钠[J]. 理化检验-化学分册, 2003, 39(8): 469–470. |
| [9] | 国际标准化组织和国际电工委员会. ISO/IEC Guide 98-3-2008《测量不确定度表述指南》[S]. 中国标准出版社, 2008. |
| [10] | 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局. JJF 1059. 1-2012《测量不确定度评定与表示》[S]. 北京: 中国质检出版社, 2012. |
| [11] | 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局. JJG 196-2006《常用玻璃量具检定规程》[S]. 北京: 中国计量出版社, 2006. |