总大肠菌群是环境中水污染程度的一个重要指标^[1]，一般认为该菌群包括大肠杆菌、枸椽酸杆菌、产气克雷伯菌和阴沟肠杆菌等。其数值的大小表示饮用水被粪便污染的程度。农村集中式供水多为中小型规模，且分布较为分散，样品从采集到送达实验室时间较长，质量控制难度大，易影响细菌学指标检测结果。当遇到地震、洪水等自然灾害，供水管网遭受破坏，饮用水受到污染，直接饮用后可能会爆发疾病^[2]，更要加强对灾害后饮用出厂水和管网末梢水细菌学指标监测。但国标方法检测所用的乳糖发酵管内含小导管，携带途中因颠簸会有气体进入小导管，影响实验结果观察。供水企业与检测单位迫切需要更为科学、简单、适合野外实验室操作的方法。

1 材料与试剂

恒温培养箱 (MIR-262型，日本SANY)；加样器 (Midi Plus型，德国sartorius)；振荡器 (MS2型，德国IKA)；生物安全柜 (IIA2型，美国LABCONCO)；天平 (TE612-L型，德国sartorius)。

1.1 试剂

蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠 (均购自青岛海博生物技术有限公司)，溴甲酚紫乙醇溶液、蒸馏水、透视窗式乳糖胆盐发酵培养基管 (单料，双料；均购自北京君立康科技发展有限责任公司)，革兰氏染液、伊红美蓝平板 (均购自北京陆桥技术股份有限公司)。

1.2 菌种

大肠杆菌 (8099购自中国食品药品检定研究院)。

2 方法 2.1 检测步骤

参照《生活饮用水标准检验方法》(GB/T 5750.12-2006)^[3]，取10 mL水样分别接种到5支10 mL小导管式乳糖蛋白胨培养液中 (双料)；取5 mL水样分别接种到5支10 mL小导管式乳糖蛋白胨培养液中 (单料)，每管1 mL；取0.5 mL水样分别接种到5支10 mL小导管式乳糖蛋白胨培养液中 (单料)，每管0.1 mL。

参照《生活饮用水标准检验方法》(GB/T 5750.12-2006)^[3]，取10 mL水样分别接种到5支10 mL透视窗式双料乳糖胆盐发酵培养基管 (双料)；取5 mL水样分别接种到5支10 mL透视窗式乳糖胆盐发酵培养基管 (单料)，每管1 mL；取0.5 mL水样分别接种到5支10 mL透视窗式乳糖胆盐发酵培养基管 (单料)，每管0.1 mL。

将接种水样后的试管放置在36℃±1℃培养箱内培养24 h，每批试验用灭菌去离子水做对照样品。将产酸产气的试管培养液分别接种于伊红美蓝琼脂平板上，放置在36℃±1℃培养箱内培养24 h。

2.2 水样加标

将大肠杆菌 (8099)24 h肉汤培养液用灭菌生理盐水做10倍梯度稀释至10^-5。每个稀释度需更换1支1 mL灭菌吸管，震荡混匀。取10^-5肉汤培养液1 mL加入到1 000 mL无菌去离子水中，震荡混匀，配制10^-6待测水样；取10^-4肉汤培养液1 mL加入到1 000 mL无菌去离子水中，震荡混匀，配制为10^-5待测水样。

参照《生活饮用水标准检验方法》(GB/T 5750.12-2006)^[3]，对10份实验室加标水样同时用透视窗式乳糖胆盐发酵培养基管和小导管式乳糖蛋白胨培养液进行检测。

2.3 野外环境水样对比试验

参照《地下水质检验方法水样的采集和保存》(DZ/T 0064.2-1993)^[5]，用塑料桶取护城河水样500 mL，4 h内送临时实验室检测。以无菌去离子水对采集的护城河水样做1: 10和1: 100稀释。参照《生活饮用水标准检验方法》(GB/T 5750.12-2006)^[3]分别用透视窗式乳糖胆盐发酵培养基管和小导管式乳糖蛋白胨培养液对44份水样进行检测。

2.4 结果判定

观察培养后的菌落形态，挑取可疑菌落做革兰氏染色镜检和证实实验。染色后确认为革兰氏阴性无芽孢杆菌，且接种乳糖胆盐发酵培养基管或乳糖蛋白胨培养液培养后有产酸产气者，方可确定为有总大肠菌群存在。根据总大肠菌群MPN (most probable number，最可能数) 检索表判断总大肠菌群数量。

2.5 质量控制

培养液感官及理化特性参照《中华人民共和国药典》^[4](2010年版) 进行评价。培养液应为紫色液体，无刺激性气味，无肉眼可见杂质，澄清度良好，pH为7.2。试验过程中严格按照无菌操作规程进行，防止污染。

2.6 数据整理

使用Excel 2007进行数据整理，因水中微生物分布结果符合对数正态分布，对结果进行对数处理后进行配对t检验，α=0.05。

3 结果 3.1 两种乳糖培养液对实验室加标水样检测

两种乳糖培养液分别检测10份实验室加标水样中大肠杆菌，t=0.639＜t_{(0.05, 9)}=2.262)，结果无统计学差异 (图 1)。

3.2 两种乳糖培养液对野外环境水样检测结果

取44份环境水样分别用两种乳糖培养液进行总大肠菌群检测 (图 2)。对2组数据进行配对t检验，表明两组结果无统计学差异 (t=0.291＜t_{(0.05, 43)}=2.917)。

4 讨论

两种乳糖培养液通过实验室加标水样及野外环境水样进行检测比较，结果均无统计学差异。说明透视窗式乳糖胆盐发酵培养基管可以替代小导管式乳糖蛋白胨培养液。由于实验室配置乳糖蛋白胨培养液费时费力^[6]，且在运输过程中因路途颠簸，玻璃试管容易破碎，其内部小导管容易有气泡进入，操作时又无法将气泡排除，影响实验结果。透视窗式乳糖胆盐发酵培养基管的内嵌件与试管底部两平面组成封闭集气结构，当微生物生长产生气体时，气体可被充分收集，形成紧贴试管平面的明亮气泡，观察时清晰明确。当因颠簸透视窗进气后可轻弹试管壁排出气泡，不影响实验结果。在野外简易实验室操作时，透视窗式乳糖胆盐发酵培养基管盖容易开合，可单手操作，避免加样过程中的污染。其塑料试管便于运输，观察后试管便于灭菌处理。因此，透视窗式乳糖胆盐发酵培养基管更适于在各地小型水厂及野外总大肠菌群的检测。