, , , , , , , , ZHANG Liubo
冰箱作为家庭储存食物的主要容器，其卫生状况直接影响食物的微生物污染情况。欧洲食品安全局(EFSA)的数据显示，2010年，法国36%食源性疾病发生在家庭。荷兰、德国和西班牙，发生在家庭的食源性疾病则高达50%以上[1-2]。为了解家用冰箱卫生现状，随机选取30台家用冰箱，调查冷藏室内部的致病微生物污染状况。
1.1 材料与方法 1.1 采样对象本项目于2014年5—6月进行，随机选择北京市30户普通居民家庭(实验室周边小区，且自愿参与本项目的家庭)，由采样员入户对冰箱冷藏室内部采样，每台冰箱采3份样品，分别为放置蔬菜的蔬菜框、放置鸡蛋的蛋架(或蛋框)和放置熟食或水果等即食食物隔板。
1.2 材料 1.2.1 试剂缓冲蛋白胨水(BPW)、0.1%吐温-80的0.03 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS；稀释液)、SCDLP、乳糖胆盐、伊红美蓝琼脂、Rappaport-Vassiliadis broth增菌肉汤、煌绿琼脂、MLCB琼脂、李斯特菌增菌肉汤(LB1 LB2)、李斯特菌选择性培养基、GN增菌液、麦康凯琼脂平板、HE琼脂平板、耶尔森氏菌选择性(CIN)培养基(以上试剂均由北京陆桥技术有限责任公司生产)；Baird Parker培养基、卵黄亚碲酸钾溶液(美国碧迪医疗器械(上海)有限公司生产)。
1.2.2 菌株大肠杆菌8099、金黄色葡萄球菌ATCC 6538(均为中国科学院微生物菌种保藏中心生产)。
1.2.3 试剂盒革兰染色试剂盒、细菌鉴定试剂盒(美国BioMerieux’ Inc生产)。
1.2.4 仪器和耗材细菌鉴定仪(VITEK2，美国BioMerieux’ Inc生产)、浊度计(美国BioMerieux’ Inc生产)、电动混匀器(美国scientific industries.Inc生产)、恒温培养箱(韶关市科力实验仪器有限公司生产)、平皿、三角烧瓶、规格板、试管、刻度吸管(1.0、5.0、10.0 mL)、棉签等。
1.3 采样方法参照《消毒技术规范》(2002年版)[3]进行采样，将无菌棉拭在含25 mL采样液(BPW)的离心管中沾湿，对采样区进行涂抹采样，每个样本采集10 cm×10 cm，采样后，以无菌操作方式将棉拭采样端剪入原采样液离心管，4 h内送实验室检测。
1.4 实验方法 1.4.1 样品处理用电动混合器混合30 s(或在手掌上用力振敲200次)，将菌洗下形成菌悬液，备用。
1.4.2 纯化培养大肠杆菌纯化步骤：取5 mL样液加入50 mL乳糖胆盐发酵管中，35℃±2℃培养24 h；自上述增菌培养液中取1~2接种环，划线接种于伊红美蓝琼脂平板，35℃±2℃培养24 h，挑取典型单个菌落分纯培养。
金黄色葡萄球菌纯化步骤：取5 mL样液加入50 mL SCDLP培养液中，35℃±2℃培养24 h；自上述增菌培养液中取1~2接种环，划线接种于Baird Parker培养基，置36℃±1℃培养24~48 h，挑取典型单个菌落分纯培养。
沙门菌纯化步骤：样液37℃培养24 h；取5 mL加入50 mL Rappaport-Vassiliadis broth增菌肉汤中，42℃培养24 h；自上述增菌培养液中取1~2接种环，划线接种于MLCB琼脂和煌绿琼脂平板，37℃培养24 h，挑取典型单个菌落分纯培养。
李斯特菌纯化步骤：取1mL样液加入9 mL LB1增菌液中，30℃±1℃培养24 h；取上述增菌液0.1 mL加入10 mL LB2增菌液中，30℃±1℃培养18~24 h；自上述增菌培养液中取1~2接种环，划线接种于李斯特选择性培养基，置36℃±1℃培养24~48 h，挑取典型单个菌落分纯培养。
志贺菌纯化步骤：取1mL样液加入9 mL GN增菌液中，36℃±1℃培养6~8 h；自上述增菌培养液中取1~2接种环，划线接种于HE琼脂平板和麦康凯琼脂平板，36℃±1℃培养18~24 h，挑取典型单个菌落分纯培养。
耶尔森菌纯化步骤：样液26℃±1℃培养48 h；自上述增菌培养液中取1~2接种环，划线接种于CIN，26℃±1℃培养48 h，挑取典型单个菌落分纯培养。
1.4.3 革兰染色将上述经2~3次分纯培养的细菌用革兰染色法，经初染—媒染—脱色—复染四个步骤，镜检后分出G+ 菌和G-菌。试验设大肠杆菌8 099为G-对照菌，金黄色葡萄球菌ATCC 6538为G+对照菌。
1.4.4 种类鉴定挑取18 h内的细菌新鲜培养物(单个菌落)制成0.5~0.63个麦氏单位的菌悬液，将GP 213142鉴定卡插入装有G+菌的悬液管，GN 213141鉴定卡插入装有G-菌的悬液管，并将鉴定卡装入VITEK2细菌鉴定仪内，运行7~24 h后查看鉴定结果。
2 结果本项目采样30台冰箱，其中国产冰箱为占66.67%，进口冰箱占33.33%；使用时间不超过5年的占56.67%，在5—10年之间的占20%，10年及以上的占23.33%；所有冰箱冷藏室温度均设置为4℃。
本研究从30台冰箱的90个样品中，共分离到51种不同细菌，共251株，其中G+菌18种，共101株；G-菌33种，共150株。冰箱冷藏室内不同部位分离到的细菌种类和株数基本一致(表 1)。
| 类型 | 蔬菜框 | 蛋架(或蛋框) | 隔板 | |||
| 种类 | 株数 | 种类 | 株数 | 种类 | 株数 | |
| G+ | 13 | 31 | 15 | 36 | 11 | 34 |
| G- | 20 | 51 | 16 | 45 | 21 | 54 |
| 合计 | 33 | 82 | 31 | 81 | 32 | 88 |
90个冰箱冷藏室样品中，分离到金黄色葡萄球菌7株，检出率为7.78%；分离到大肠杆菌4株，检出率为4.44%；未分离到沙门菌、志贺菌、李斯特菌和耶尔森菌(表 2)。
| 目标菌名称 | 株 数 | 检出率 /% | 来源 | ||
| 蔬菜框 | 蛋架(或蛋框) | 隔板 | |||
| 金黄色葡萄球菌 | 7 | 7.78 | 1 | 4 | 2 |
| 大肠杆菌 | 4 | 4.44 | 1 | 3 | 0 |
| 沙门菌 | 0 | 0.00 | 0 | 0 | 0 |
| 志贺菌 | 0 | 0.00 | 0 | 0 | 0 |
| 李斯特菌 | 0 | 0.00 | 0 | 0 | 0 |
| 耶尔森菌 | 0 | 0.00 | 0 | 0 | 0 |
除上述目标菌外，还有G+菌17种，包括松鼠葡萄球菌(21株)、托尔豪特链球菌(21株)和克氏库克菌(11株)等；G-菌32种，包括阴沟肠杆菌(39株)、肺炎克雷伯菌(16株)和黏质沙雷菌(12株)等(表 3、表 4)。
| 名称 | 不同部位分离到的细菌株数 | 合计 | ||
| 蔬菜框 | 蛋架(或蛋框) | 隔板 | ||
| 松鼠葡萄球菌 | 7 | 5 | 9 | 21 |
| 托尔豪特链球菌 | 8 | 4 | 9 | 21 |
| 克氏库克菌 | 2 | 5 | 4 | 11 |
| 金黄色葡萄球菌 | 1 | 4 | 2 | 7 |
| 铅黄肠球菌 | 2 | 1 | 3 | 6 |
| 沃氏葡萄球菌 | 3 | 1 | 1 | 5 |
| 木糖葡萄球菌 | 2 | 3 | 0 | 5 |
| 粪肠球菌 | 1 | 2 | 0 | 3 |
| 屎肠球菌 | 0 | 2 | 1 | 3 |
| 鹑鸡肠球菌 | 1 | 1 | 1 | 3 |
| 产色葡萄球菌 | 1 | 2 | 0 | 3 |
| 马胃葡萄球菌 | 1 | 2 | 0 | 3 |
| 血球链菌 | 0 | 0 | 2 | 2 |
| 变异库克菌 | 0 | 2 | 0 | 2 |
| 表皮葡萄球菌 | 1 | 0 | 1 | 2 |
| 溶血葡萄球菌 | 0 | 1 | 1 | 2 |
| 格氏乳球菌 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 中间链球菌 | 1 | 0 | 0 | 1 |
| 合计 | 31 | 36 | 34 | 101 |
| 名称 | 不同部位分离到的细菌株数 | 合计 | ||
| 蔬菜框 | 蛋架(或蛋框) | 隔板 | ||
| 阴沟肠杆菌 | 13 | 12 | 14 | 39 |
| 肺炎克雷伯菌 | 7 | 3 | 6 | 16 |
| 粘质沙雷菌 | 5 | 2 | 5 | 12 |
| 赫氏埃希菌 | 3 | 5 | 1 | 9 |
| 产酸克雷伯菌 | 0 | 5 | 3 | 8 |
| 少动鞘氨醇单胞菌 | 3 | 3 | 2 | 8 |
| 产气肠杆菌 | 3 | 0 | 3 | 6 |
| 雷氏普罗威登斯菌 | 2 | 1 | 2 | 5 |
| 粪产碱菌粪亚种 | 0 | 0 | 4 | 4 |
| 弗氏柠檬酸杆菌 | 2 | 0 | 2 | 4 |
| 大肠杆菌 | 1 | 3 | 0 | 4 |
| 恶臭假单胞菌 | 1 | 2 | 1 | 4 |
| 杀鲑杀鲑气单胞菌 | 2 | 0 | 1 | 3 |
| 非脱羧勒克菌 | 0 | 3 | 0 | 3 |
| 绿浅气球菌 | 0 | 1 | 1 | 2 |
| 成团泛菌 | 1 | 1 | 0 | 2 |
| 泛菌属某些种 | 1 | 0 | 1 | 2 |
| 铜绿假单胞菌 | 1 | 0 | 1 | 2 |
| 解鸟氨酸拉乌尔菌 | 0 | 0 | 2 | 2 |
| 普城沙雷菌 | 1 | 0 | 1 | 2 |
| 温和气单胞菌 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 耳炎差异球菌 | 1 | 0 | 0 | 1 |
| 戴氏西地西菌 | 1 | 0 | 0 | 1 |
| 无丙二酸柠檬酸杆菌 | 0 | 0 | 1 | 1 |
| 布氏柠檬酸杆菌 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 法氏柠檬酸杆菌 | 0 | 0 | 1 | 1 |
| 杨氏柠檬酸杆菌 | 0 | 0 | 1 | 1 |
| 生癌肠杆菌 | 1 | 0 | 0 | 1 |
| 摩氏摩根菌塞氏亚种 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 浅黄假单胞菌 | 1 | 0 | 0 | 1 |
| 放射根瘤菌 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 居泉沙雷菌 | 0 | 0 | 1 | 1 |
| 嗜麦芽寡养单胞菌 | 1 | 0 | 0 | 1 |
| 合计 | 51 | 45 | 54 | 150 |
3 讨论
人们普遍认为冰箱是食物的“保险柜”，然而事实并非如此。Dieuleveux等[4]在法国研究60台冰箱时，从其中1台冰箱的蔬菜隔板中分离到李斯特菌。Rohini Kumar等[5]在南印度的韦洛尔县研究冰箱微生物污染时，从冰箱内壁分离到沙门菌、大肠杆菌和志贺菌等10种病原菌。本研究从30台家用冰箱冷藏室的90个样品中，分离到金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等51种不同细菌，其中G+菌18种，G-菌33种。由此可见，冰箱并没有我们想象中的那么“安全”，家用冰箱冷藏室致病菌污染严重是一个国内外普遍存在的问题。
国内有学者报道[6]，家庭冰箱中的细菌主要以芽孢杆菌(Bacillus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、库克菌(Kocuria)和假单胞菌(Pseudomonas)属的菌株为主，真菌则以枝孢菌(Cladosporium)、曲霉(Aspergillus)和青霉(Penicillium)属的霉菌为主。国外对家用冰箱卫生状况研究起步较早，相关报道较多。Bolton等[7]在爱尔兰从冰箱样品中分离到金黄色葡萄球菌、沙门菌、单增李斯特菌和耶尔森菌等多种食源性致病菌，检出率从2% ~40%不等。Catellani等[8]在意大利随机采样293台家用冰箱冷藏室，从其内壁和底部分离到沙门菌(1.4%)，但未分离到李斯特菌和耶尔森菌。Jackson等[9]在爱尔兰采样342台家用冰箱冷藏室，从其内壁分离到金黄色葡萄球菌(6.4%)、单增李斯特菌(1.2%)和耶尔森菌(0.6%)等多种食源性致病菌和克雷伯杆菌、阴沟肠杆菌、假单胞菌等条件致病菌。苏丹学者Abdalla等[10]报道，在150台家用冰箱中分离到金黄色葡萄球菌(9.5%)、单核李斯特菌(3.8%)、大肠杆菌(2%)和耶尔森菌(1.6%)。墨西哥研究人员Macías-Rodríguez等[11]在研究200台冰箱时发现，冰箱架子、蔬菜框和擦拭冰箱用抹布等物体上微生物污染较为严重，并从中分离到单核李斯特菌(59.5%)和沙门菌(32.5%)。本研究将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门菌、志贺菌、李斯特菌和耶尔森菌等6种常见的食源性致病菌作为目标菌，对家用冰箱冷藏室内壁进行研究，结果除金黄色葡萄球菌和大肠杆菌外，其他4种菌均未分离到。从90份样品中分离到金黄色葡萄球菌7株(7.78%)和大肠杆菌4株(4.44%)，检出率与国外相关报道类似；未能分离到沙门菌、志贺菌、李斯特菌和耶尔森菌，其可能原因是样本量较少，且检出率较低。
本研究还分离到49种条件致病菌，其中部分细菌有文献报道，如克雷伯杆菌、阴沟肠杆菌、假单胞菌等[6-9]，但多数细菌未见其他文献报道，为首次从家用冰箱冷藏室中分离到。冰箱冷藏室的微生物污染状况可能与冰箱使用时间、放置物品种类和方式、日常清洗维护等多种因素有关，但由于本研究主要目的是对污染的微生物进行种类分析，故未对冰箱微生物污染相关因素进行研究，冰箱污染的影响因素有待于进一步的分析研究。
各国学者研究报道均表明致病菌可在冰箱冷藏室内存活，且致病菌种类较多，对人们构成潜在健康风险。我们不能完全排除食物中的致病菌，但可以对食物进行正确的储存和加工，对食物接触部位进行定期的清洗和消毒，从而抑制致病菌的扩散，减少或消除潜在的安全隐患。
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