2. 新疆维吾尔自治区胸科医院超声科
脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase LPL)是血浆脂蛋白中甘油三酯(TG)代谢的关键酶,催化乳糜微粒(CM)和极低密度脂蛋白(VLDL)中的TG水解。此外,LPL还具有增加乳糜微粒残粒结合到LPL受体上的能力,促进乳糜微粒残粒摄取,从而调节血浆中脂质浓度,还可以促进高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的成熟[1]。脂蛋白脂酶与脂质代谢密切相关,其PvuⅡ酶切位点突变是LPL基因较为常见的突变之一,其突变位点涉及外显子、内含子和启动子,众多突变可能会对LPL活性、脂蛋白代谢和LPL其他功能等造成重要影响[2]。LPL基因PvuⅡ酶切位点多态性可能与脂质代谢紊乱、高血压、动脉硬化及冠心病等疾病有关联[3]。目前研究显示内含子6区的PvuⅡ酶切位点多态性影响血脂的水平,与高脂血症及冠心病的发生可能有关[4-6],但各地区和不同种族间基因多态性的分布可能存在差异。本文研究塔里木沙漠腹地健康维吾尔族人群LPL基因PvuⅡ酶切位点多态性特征及其相关体质测量和血生化指标的相关性,并与不同种族人群进行比较,为进一步研究LPL基因多态性与相关疾病的发病以及预防和治疗提供分子流行病学资料。
1 研究方法 1.1 受试者选取随机抽取99例生活在新疆地区塔里木沙漠边缘尼雅健康维吾尔人群。获取各项指标和在正常范围健康维吾尔族男女人群(男38例,女61例)人的血样,经检查,已排除患冠心病、高血压、糖尿病、心肌病、心脑血管疾病和先天性心脏病的受检者,并与受检者签署知情同意书。
1.2 相关试剂及仪器引物由上海生工生物工程公司设计合成,DNA Ladder购于宝生物工程大连有限公司,100 mol/L dNTPs(含Mg2+)、2 U/μL TaqDNA聚合酶均购于北京鼎国生物技术有限责任公司。所用试剂均为进口或国产分析纯。BIOMETRA型基因扩增仪(德国Biometra公司),DYY-Ⅲ5型电泳仪和M-15E 8-瓦特302nm 15x15cm紫外图像分析系统(美国UPV公司),Primo R型高速冷冻离心机(德国Hereaus公司)。
1.3 提取基因组DNA及测定临床生化指标对所有样本进行流行病学调查,并测定身高、体质量、空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyeride,TG)等临床指标,计算体质量指数(body mass index,BMI)。抽取受试者空腹静脉血5 mL,EDTA抗凝,采用盐析法提取基因组DNA。
1.4 LPL基因PvuII酶切位点检测参照文献[10]设计引物。PvuⅡ上游引物:5’-ATGGCACCCATGTGTAAGGTG-3’;下游引物:5’-GTTAACTTCTGATAACAATCTC-3’引物由上海生工合成。PCR试剂盒购于TaKaRa公司,PCR反应体系为25 μL,其中包含100 ng基因组DNA,1 U Taq DNA聚合酶引,物各10 pmol/L,4×dNTP(10 mmol/L)为2.5 μL,10×PCR buffer为2.5 μL,MgCI2(25 mmol/L)为1.5 μL,加去离子水补至终体积25 μL。反应条件:94℃ 5 min预变性,94℃ 90 s,53℃ 60 s,68℃ 60 s,循环次数35次;70℃延伸5 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳,EB染色检测扩增结果。
1.5 酶切反应及基因多态性将PCR产物进行酶切。酶切反应在EP管中进行,20 μL酶切体系:BSA 0.2 μL,10 × NE缓冲液2 μL,内切酶MspA1I 0.5 μL,PCR产物10 μL,37℃反应4 h。2%的琼脂糖凝胶电泳结果如图 1可见酶切产物呈现出3种状态,即未切开,部分切开及全部切开,提示该基因存在着3种基因型,即P+P+,P+P-,P-P-。
1.6 统计学分析经过Hardy Weinberg遗传平衡定律检验各基因型频率是否达遗传平衡,具有群体代表性。应用SPSS 17.0软件包进行统计分析,组内不同基因型间生化指标比较采用t检验,组间等位基因频率基因型分布差异采用卡方检验,P<0.05为有统计学意义。
2 研究结果 2.1 酶切片段电泳电泳结果见图 1,脂蛋白酯酶(LPL)基因PVuⅡ位点位于LPL基因第6内含子,其多态性因一个碱基替换(C-T)而形成,根据该酶切位点的有无,扩增产物酶切后经琼脂糖凝胶电泳分析,共发现3种基因型:P-P-基因型(431bp无,PvuⅡ酶切位点);P+P-基因型(431bp,323bp1,08bp);P+P+基因型(323bp1,08bp)型。
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注:M,DL2000分子标记;1、5,P-P-;4、6、7,P+P-;2、3,P+P+ 图 1 LPL基因PvuⅡ酶切位点的PCR-RFLP检测结果 |
2.2 基因型和等位基因频率
由表 1可知新疆维吾尔族人群中P+P+基因型频率为21.21%,P+P-基因型频率为61.62%,P-P-基因型频率为17.17%,P +等位基因频率为52.02%,P-等位基因频率为47.98%。LPL基因PvuⅡ酶切位点基因型在总体样本两组中的分布符合Hardy-weinberg平衡,说明样本具有良好的代表性(P>0.05)。经χ2检验发现,LPL基因PvuⅡ多态位点各基因型及等位基因频率在男性组和女性组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。由此可见,LPL基因PvuⅡ多态性与性别无关。
组别 | 基因型频率/% | χ2 | P | 等位基因频率/% | χ2 | P | |||
P+P+ | P+P- | P-P- | P+ | P- | |||||
男(38) | 10(26.32) | 21(55.26) | 7(18.42) | 41(53.95) | 35(46.05) | ||||
女(61) | 11(18.03) | 40(65.57) | 10(16.39) | 1.217 | 0.544 | 62(50.82) | 60(49.18) | 0.184 | 0.668 |
全部(99) | 21(21.21) | 61(61.62) | 17(17.17) | 103(52.02) | 95(47.98) | ||||
Hardy-Weinberg | χ2=2.959 | ||||||||
遗传平衡检验 | P=0.228 |
2.3 LPL基因PvuⅡ各基因型和身体测量及血生化指标在维吾尔族男性人群中的分布
由表 2可知对男性总体样本不同基因型间进行单因素方差分析表明,LPL基因PvuⅡ位点不同基因型间各项身体测量和血脂指标均未见显著性差异(P>0.05),但男性组中P-P-基因型组空腹血糖水平显著高于P+P+、P+P-基因型组,空腹血糖与基因型间有显著性差异(P<0.05)。
基因型男 | 身高/cm | 体重/kg | BMI /(kg/m2) | FPG /(mmol/L) | TC /(mmol/L) | TG /(mmol/L) | SBP /mmHg* | DBP /mmHg* |
P+P+(n=10) | 169.50±9.87 | 57.10±9.11 | 19.81±2.16 | 4.22±0.31 | 3.57±1.19 | 1.21±0.59 | 62.73±4.67 | 104±8.43 |
P+P-(n=21) | 172.09±5.17 | 59.19±7.84 | 19.97±2.05 | 4.21±0.45 | 3.16±0.82 | 0.97±0.52 | 62.05±4.38 | 101.91±6.79 |
P-P-(n=7) | 171.43±5.79 | 55.28±5.12 | 18.78±1.02 | 4.31±0.16 | 3.16±0.42 | 0.82±0.29 | 63±4.83 | 102.86±7.56 |
χ2值 | 2.659 | 1.358 | 1.024 | 3.411 | 1.081 | 0.898 | 0.192 | 0.048 |
P值 | 0.081 | 0.273 | 0.372 | 0.044 | 0.353 | 0.795 | 0.417 | 0.953 |
注:体质量指数(body mass index,BMI)、空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyeride,TG)、收缩压(systolic blood pressure,SBP)、舒张压(diastolic blood pressure,DBP); *1 mmHg=133.28Pa |
2.4 LPL基因PvuⅡ各基因型和身体测量及血生化指标在维吾尔族女性人群中的分布
由表 3可知同样,在女性组中LPL基因PvuⅡ位点不同基因型间各项身体测量指标和空腹血糖、甘油三酯等指标均未见显著性差异(P>0.05),但女性组中P-P-基因型组总胆固醇水平显著高于P+P-、P+P+基因型组,总胆固醇与基因型间有显著性差异(P<0.05)。
基因型男 | 身高/cm | 体重/kg | BMI /(kg/m2) | FPG /(mmol/L) | TC /(mmol/L) | TG /(mmol/L) | SBP /mmHg* | DBP /mmHg* |
P+P+(n=11) | 155.18±3.84 | 46.18±5.44 | 20.02±2.41 | 4.05±0.36 | 2.85±0.28 | 1.04±0.35 | 62.73±4.67 | 92.73±4.67 |
P+P-(n=40) | 156.65±9.69 | 50.45±7.52 | 20.36±2.57 | 4.14±0.29 | 3.11±0.75 | 0.96±0.49 | 62.05±4.38 | 92.75±4.52 |
P-P-(n=10) | 160.50±3.95 | 50.50±5.54 | 19.61±2.04 | 4.25±0.34 | 3.46±1.26 | 1.10±0.43 | 63±4.83 | 93±4.83 |
χ2值 | 0.298 | 1.329 | 0.829 | 1.665 | 4.669 | 0.230 | 0.192 | 0.048 |
P值 | 0.743 | 0.273 | 0.442 | 0.198 | 0.013 | 0.795 | 0.826 | 0.953 |
注:体质量指数(body mass index,BMI)、空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyeride,TG)、收缩压(systolic blood pressure,SBP)、舒张压(diastolic blood pressure,DBP); *1 mmHg=133.28 Pa |
2.5 不同地区健康民族人群LPL基因PvuⅡ位点多态性比较分析
由表 4可知将维吾尔族人群与海南黎族人群[8]基因型(χ2=7.588,P=0.023) 和等位基因(χ2=3.009,P =0.083) 间﹑海南汉族人群[8]基因型(χ2=14.565,P=0.001) 和等位基因(χ2=5.719,P=0.017) 间﹑大连汉族人群[9]基因型(χ2=24.771,P=0.001) 和等位基因(χ2=10.813,P=0.001) 间﹑郑州汉族人群[10]基因型(χ2=16.501,P=0.001) 和等位基因(χ2=12.531,P=0.001) 间研究比较发现,不同地区的民族以基因型和等位基因频率均存在显著差异(P<0.01,P<0.05)。这种差异是LPL基因PvuⅡ酶切位点具有民族特异性与地区差异,这就为该基因位点相关疾病的研究、预防和治疗提供了帮助。
族别 | 例数 | 基因型频率/% | 等位基因频率/% | |||
P+P+ | P+P- | P-P- | P+ | P- | ||
海南黎族 | 146 | 54(37.00)■ | 67(45.90)■ | 25(17.10)■ | 175(59.90)■ | 117(40.10)■ |
海南汉族人 | 148 | 64(43.20)★ | 58(39.20)★ | 26(17.60)★ | 186(60.80)★ | 110(39.20)★ |
大连汉族人 | 106 | 56(52.83)★ | 32(30.19)★ | 18(16.98)★ | 144(67.93)★ | 68(32.07)★ |
郑州汉族人 | 101 | 49(48.50)★ | 42(41.50)★ | 10(10.00)★ | 140(69.25)★ | 62(30.75)★ |
维吾尔族 | 99 | 21(21.21) | 61(61.62) | 17(17.17) | 103(52.02) | 95(47.98) |
注:■表示(P<0.05),★表示(P<0.01) |
2.6 不同种族健康人群之间LPL基因PvuⅡ位点基因多态性比较
由表 5可知将维吾尔族与日本人群基因型(χ2=25.809,P=0.001) 和等位基因(χ2=22.545,P=0.001) 间、阿拉伯人群基因型(χ2=8.063,P=0.018) 和等位基因(χ2=4.227,P=0.04) 间﹑土耳其人群基因型(χ2=8.348,P=0.015) 和等位基因(χ2=4.631,P=0.031) 中国汉族人群基因型(χ2=19.165,P=0.001) 和等位基因(χ2=13.016,P=0.001) 间、韩国人群基因型(χ2=27.792,P=0.001) 和等位基因(χ2=9.090,P=0.003) 间、研究比较发现不同种族间以基因型和等位基因频率均存在显著差异(P<0.01,P<0.05);这说明基因多态性的种族差异,可以造成不同种族间对于某些疾病的易感性不同。
组别 | 例数 | 基因型频率/% | 等位基因频率/% | |||
P+P+ | P+P- | P-P- | P+ | P- | ||
日本[11] | 111 | 59(53.20)★ | 47(43.30)★ | 5(4.50)★ | 165(74.30)★ | 57(25.70)★ |
芬兰[12] | 240 | 44(18.30)□ | 133(55.40)□ | 63(26.30)□ | 221(46.00)□ | 259(54.00)□ |
阿拉伯[13] | 511 | 182(35.62)■ | 248(48.53)■ | 81(15.85)■ | 612(59.88)■ | 410(40.12)■ |
土耳其[14] | 295 | 55(18.60)■ | 145(49.20)■ | 95(32.20)■ | 255(43.20)■ | 335(56.80)■ |
印度[15] | 241 | 69(28.75)□ | 133(55.42)□ | 39(16.25)□ | 271(56.46)□ | 211(43.54)□ |
汉族[16] | 252 | 117(46.43)★ | 102(40.47)★ | 33(13.09)★ | 336(66.67)★ | 168(33.33)★ |
韩国[17] | 270 | 35(12.96)★ | 107(39.63)★ | 128(47.41)★ | 240(32.78)★ | 363(67.22)★ |
维吾尔族 | 99 | 21(21.21) | 61(61.62) | 17(17.17) | 103(52.02) | 95(47.98) |
注:■表示(P<0.05),★表示(P<0.01),□表示(P>0.05) |
3 讨论
脂蛋白脂肪酶是由脂肪细胞、骨骼肌细胞、乳腺细胞及巨噬细胞等实质细胞合成的由448个(人类)左右的氨基酸残基组成的一种蛋白水解酶。人类的LPL基因位于8p 22,长度为30~35 kb,含10个外显子和9个内含子,共编码475个氨基酸,包括27个氨基酸残基(亲水端氨基酸)的信号肽。LPL的主要生理功能与催化乳糜微粒(CM)和极低密度脂蛋白(VLDL)核心的甘油三酯(TG)分解为游离脂肪酸和单酸甘油酯,以供组织氧化供能和储存需要[18]。
研究表明,LPL的突变具有广泛性,蛋白脂酶基因多态性与血脂水平关系密切,并对与糖尿病、高血压、动脉硬化、心血管及其相关疾病的发生发展产生重要影响,且不同地域和种族间的发病率也不同,除环境和生活方式与此有关外,不同的LPL基因型可能作为遗传背景参与了这些疾病的发生、发展[19]。研究我国正常人群LPL基因多态性的分布特点,有利于LPL基因多态性与某些疾病关系的研究,从而更深入的理解这些疾病在不同民族、不同种族间所具有的不同发病机制和遗传背景[20-21]。
本研究首次应用PCR-RFLP方法探讨了长期生活在新疆塔克拉玛干沙漠腹地的健康维吾尔族人群LPL基因PvuⅡ位点基因多态性的分布特点及其身体测量指标与血脂、血糖指标之间的相关性。结果显示,LPL基因PvuⅡ位点基因多态性分布在男女间差异不显著(P>0.05),这与性别无关;男性组中只存在空腹血糖及基因型间有显著性差异(P<0.05),女性组中只存在总胆固醇与其基因型间存在显著性差异(P<0.05),其他各项身体测量指标和生化指标分别与基因型间均未见显著性差异(P>0.05)。目前国内外对PvuⅡ基因多态性与血脂水平和疾病关系的研究结果不一致,多数国外文献报道PvuⅡ基因多态性对血脂水平无显著影响。Yin等[22]2006年对325例广西黑衣壮族人和33l例同地区汉族人进行了研究,结果显示:两民族组内各基因型间血清TG、HDL-C水平无显著性差异(P>0.05)。Duman等[23]2004年对80例土耳其冠心病患者和49例健康人进行了研究,结果显示P+P+基因型有更高的总胆固醇(total cholesteral,TC)水平和LDL水平。研究分析还提示,P+P+基因型可以对血脂水平产生影响。本研究结果发现,LPL基因PvuⅡ位点不同基因型间各项身体测量和血脂指标均未见显著性差异(P>0.05),但是在男性组中P-P-基因型组空腹血糖水平显著高于P+P+、P+P-基因型组,除了FPG以外TG及其他指标未发现组间显著性差异(P>0.05)。在女性组中P-P-基因型组总胆固醇水平显著高于P+P-、P+P+基因型组,除了各基因型与TC水平间有显著性差异以外TG及其他指标之间无存在显著性差异(P>0.05)。这些结果可能与P-P-基因型和空腹血糖、总胆固醇等血脂水平相关联,也可能与样本大小、研究人群在种族、年龄、性别上的差异以及采用的研究方法等不同有关。近年来,心血管疾病、代谢综合征和癌症等常见的复杂性疾病在全球疾病负担中的构成不断加大,复杂性疾病研究成为遗传流行病学研究的重点,由于LPL参与脂质代谢,而脂质代谢与糖代谢有密切关系,因此,推断LPL基因与糖代谢有关。大量结果表明LPL基因PvuⅡ位点多态性与血脂水平及心血管疾病等复杂性疾病相关联,开展这些疾病的遗传学基础研究,明确相关易感基因具有重要的医学意义。新疆自古以来就是多民族的聚居地,长期以来各个民族的地理环境、宗教信仰和风俗习惯等各有不同,使其彼此间相对隔离,并聚居在相对稳定的地域里,由此积累了遗传学研究难得的资源。本研究中选取了维吾尔族人最稠密的和田地区,称之为典型的维吾尔族居住地之一且环境,生活特点及风俗习惯特殊的遗传隔离群常用的单个多态性基因型与身体测量和血生化指标之间的比较研究方法。
本研究还对维吾尔族健康人群LPL基因PvuⅡ位点多态性与国内不同地区的一些群体进行比较,结果显示维吾尔族与海南黎族、海南汉族、大连汉族、郑州汉族等不同人群的基因型和等位基因频率均存在显著差异(P<0.01,P<0.05)。从世界范围来看,日本、芬兰、阿拉伯、土耳其、印度和韩国等人群相关资料与本文研究比较发现,芬兰和印度人群差异无显著(P>0.05),但是日本,阿拉伯,土耳其和韩国等不同种族间以基因型和等位基因频率均存在显著差异(P<0.01,P<0.05)。结果表明,生活在新疆塔克拉玛干沙漠腹地的维吾尔族人群LPL基因PvuⅡ位点基因多态性分布存在种族和地域差异性。根据上述研究比较国内及国外不同民族和不同种族群体的LPL基因PvuⅡ位点多态性分布特点,对于从分子流行病学角度了解LPL基因多态性在我国人群中的分布,对认识一些疾病在不同地区、不同种族表现出来的差异具有重要意义,也以便揭示各相关疾病发病的分子遗传学机理。此外,在维吾尔族健康人群LPL基因研究中得到的多态性分布数据,在新疆高发疾病的防治中可能具有较大的应用价值。同时为群体遗传学的研究提供理论依据。
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