, , ZHANG Hongwei
纳米铜是代表性的金属纳米材料之一，已作为商业化产品进入市场多年。在生物医学领域中有望代替铜化合物或微米铜材料而得到广泛应用。然而，已有研究表明纳米粒子具有的小尺寸、大比表面积及高表面活性等特征使其具有潜在危害性[1]。先期研究证明，纳米铜在体内、体外试验中均显示出不同程度的毒性作用[2-3]，体外研究表明能显著降低多种细胞活性[4]。随着对纳米氧化铜研究的逐渐深入，细致准确地测定其细胞毒性及精确的IC50值对于深入研究其毒性作用及相关机制十分重要。本研究选用常见的中国仓鼠卵巢细胞株(chinese hamster ovary CHO)作为研究对象，该细胞由于其强大的生命力、本身很少分泌内源蛋白及表达复杂生物大分子的理想宿主等特点在生物工程、药学及毒理学等体外研究中被广泛使用。实时监测不同剂量纳米氧化铜作用于CHO细胞后，观察在连续时间点所产生的毒性效应变化，对于纳米氧化铜体外毒性效应及机制研究具有普遍意义。
在体外实验中，基本都以MTT等传统方法来测定细胞的存活和生长，这些传统方法只能在人为设定的时间点进行检测，所得结果为某一个或几个定点的数值，且不同时间点的测定要用不同组别的细胞，存在组间差异。由于纳米氧化铜粒子直径仅为1 ~ 100 nm，是致密的聚集体，具有一系列的新特性(小尺寸效应、接口效应、量子效应和量子隧道效应)[5]，其作用于细胞内部所产生的毒性效应可能与传统的化学物质作用方式不同，因此按传统的毒性测定方法无法了解毒性作用的起始时间，以及随着时间的变化其精确的毒性变化效应，可能会忽略纳米材料作用于细胞毒性效应的中间变化过程。
本研究引入了RTCA实时监测技术[6]，用同一批细胞在多个连续的时间点进行长时间监测，即避免了不同批次细胞所产生的组间差异，又能实时地观察到细胞毒性起始时间及随着时间变化所产生的毒性变化效应，可以精确地计算不同时间点的IC50值，并提供连续时间点的IC50变化曲线，能清晰地了解纳米氧化铜作用于CHO细胞后所产生的毒性效应过程，为进一步的毒性机制研究提供准确可靠的信息支持。
1 材料与方法 1.1 细胞株及培养条件CHO细胞株购于南京凯基生物技术发展有限公司(KeyGEN BioTECH)。适用培养条件：1640培养基(Gibco)，10% FBS(Gibco)，1%双抗；37℃，5%CO2，饱和湿度下培养。
1.2 主要试剂、仪器纳米氧化铜混悬液(北京德科岛金科技有限公司)，黑色混悬液，晶型为球形，平均粒径40 nm，纯度＞99.9%，比表面积13.1 m2/g，体积密度0.79 g/cm3。real-time cell analyzer(RTCA仪)及配套16孔板均购自物艾森生物有限公司(ACEA)。RTCA是新型的实时细胞分析系统，该系统配套的CIM-Plate-16底面积为0.32 cm2，与常规96孔板规格一致，但是其聚碳脂膜背面嵌入了微金电极阵列，用以构建实时、连续、定量跟踪细胞形态和数目改变的细胞阻抗测试传感器，细胞穿过聚碳脂膜后在其背面的微电极表面贴壁生长，可引起贴壁电极界面阻抗的改变，获得细胞指数变化曲线图，能够客观地反映细胞生长状况[7]。本研究利用RTCA系统中的PLOT模块对受试细胞进行实时监测，采用无量纲细胞指数(cell index，CI)实时描述细胞生长状态，并得到任何时间点的CI值，绘制细胞生长曲线。选择DATA ANALYZE模块中可SLOP项，得到不同时间段的生长曲线斜率；在细胞毒性研究实验中，选择该模块中IC50项对不同时间点进行IC50值的计算并进行拟合分析，同时可得到IC50曲线。
1.3 CHO细胞完整生长曲线测定取状态良好的CHO细胞用完全培养液充分混匀，按不同密度铺于配套16孔板中，每孔100 μL。细胞密度梯度设置为1×105、5×104、2.5×104和1.25×104个/mL，每个密度设2复孔。
RTCA程序设置5 min进行一次细胞CI值的测试，连续测试50 h。CI值为RTCA基于微电子阻抗的检测技术进行细胞活性检测的细胞指数单位，无量纲，所代表的是成活的贴壁细胞。通过对不同密度的细胞进行连续测定，以细胞CI值为Y轴，以时间为X轴绘制生长曲线，确定适合于毒性试验的细胞密度进行进一步毒性试验。
1.4 纳米氧化铜作用于CHO细胞的毒性试验纳米氧化铜混悬液在染毒前处理：涡旋振荡5 min，超声30 min后，取少量混悬液配制成不同浓度进行染毒。
根据已绘制出的细胞生物曲线，选择适当的细胞密度接种于配套16孔板中，每孔100 μL。置于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养约24 h后进行染毒。
纳米氧化铜设置7个不同染毒剂量，分别为2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625和0.0313 mg/mL，每个剂量2复孔。RTCA程序设置为细胞接种后在正常培养条件下自然生长，每5 min测定一个点，约24 h后进行染毒，染毒后前3 h每5 min测定一个点，3 h以后每15 min测定一个点，连续测定48 h。以细胞CI值为Y轴，以时间为X轴绘制生长曲线，观察不同剂量纳米氧化铜所产生的细胞毒性。
1.5 数据分析及绘图工具本研究采用RTCA Software Version 2.0系统进行绘图并得到相应数据结果。
2 结果 2.1 不同密度CHO细胞完整生长曲线分别选定1×10、5×104、2.5×104和1.25×104个/mL 4个细胞浓度，绘制出不同浓度完整的细胞生长曲线(图 1)。CHO细胞浓度越低，共生长曲线较为平缓，细胞增殖速度较慢。细胞浓度越高，则细胞生长曲线斜率越大，细胞增殖速度较快。
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| 图 1 不同密度CHO细胞50 h生长曲线 |
利用RTCA分析系统中DATA ANALYZE模块中SLOP项，每5 h对不同密度的生长曲线做出该时段内的平均斜率，将各时段的平均斜率进行比较，如图 2所示。
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| 图 2 不同密度CHO细胞每5 h时间段平均斜率 |
一般毒性实验是在铺板后20 ~ 24 h左右时加入受试物，结合图 2生长曲线平均斜率比较可见，1×105和5×104个/mL两个浓度的细胞生长到20 ~ 25 h时间段的平均斜率已明显增大，而2.5×104和1.25×104个/mL两个浓度的细胞生长到25 ~ 30 h及35 ~ 40 h时，其生长曲线平均斜率才有两次明显升高。因此，欲在铺板后24 h左右加入受试物染毒，可以选择的细胞浓度为1×105和5×104个/mL。再进一步对1×105、5×104个/mL两个浓度的细胞生长曲线平均斜率进行比较发现，1×105个/mL浓度的细胞在20 ~ 25 h以后各时间段的生长曲线平均斜率呈现下降趋势，而5×104个/mL浓度的细胞在20 ~ 25 h时间段以后直至35 ~ 40 h时间段的生长曲线平均斜率呈现升高趋势。充分考虑到本研究拟研究受试物纳米氧化铜对细胞长时间作用的结果，为保证在整个毒性实验过程中，细胞自身生长状态良好，因此本研究选用细胞浓度为5×104个/mL作为加入受试物的细胞浓度进行下一步试验。
2.2 不同剂量纳米氧化铜对CHO细胞存活率的影响选择5×104个/mL的细胞浓度铺板，自然生长约23 h，加入不同浓度的纳米氧化铜混悬液，得到以时间为X轴，归一细胞指数(NCi)值为Y轴的细胞生长情况曲线(图 3)。
| $ NCi\left( {Ti} \right) = \frac{{CI\left( {Ti} \right)}}{{CI\left( {Tk} \right)}}, \left[{i = 1, 2, 3, ...N} \right] $ | (1) |
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| 图 3 在纳米氧化铜混悬液作用下CHO细胞生长曲线 |
式中：NCi—归一细胞指数；
CI(Tk)—染毒前最后一个时间点的细胞指数；
CI(Ti)—被测定的时间点的细胞指数；
i—1，2，3，… N；
N—所有被测定时间点。
未加入纳米氧化铜混悬液受试物时细胞生长状况基本一致。加入受试物后，细胞的CI值略有波动，且各剂量组与空白对照组的细胞生长曲线走向基本一致，认为此时加入纳米氧化铜受试物的CHO细胞状态尚未达到稳定，还未能产生毒性作用。而纳米氧化铜染毒3 h后，不同剂量组曲线走势出现区分，且走向趋于稳定，可以认为毒性作用起始于染毒3 h后，并呈现时间依赖性持续产生毒性效应。因此在RTCA操作系统中首先选择染毒后3 h进行分析，既而选择染毒后12、24、36和48 h 4个时间点拟合剂量效应曲线，并计算其IC50值(表 1)。作用3 h剂量效应关系拟合曲线R2值低，且IC50值极高，结合图 3中细胞生长曲线结果，认为纳米氧化铜作用于CHO细胞3 h时，细胞状态尚未达到稳定，不适应在此时间点用此方法测定细胞IC50值。图 4以受试物对数浓度(g/mL)为X轴，以细胞CI值为Y值进行12、24、36和48 h 4个时间点的剂量效应拟合曲线。纳米氧化铜作用于CHO细胞12 ~ 36 h的IC50值接近，但在作用24 h的IC50值最低，而作用48 h时的IC50值又出现升高趋势。
| 作用时间/h | IC50/(mg/mL) | 拟合曲线R2 |
| 3 | 1.91 | 0.923 |
| 12 | 0.249 | 0.996 |
| 24 | 0.207 | 0.990 |
| 36 | 0.236 | 0.980 |
| 48 | 0.412 | 0.982 |
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| 图 4 纳米氧化铜作用于CHO细胞4个作用时间点剂量—效应拟合曲线 |
根据上述结果，本研究在RTCA操作系统中进行了连续时间点的IC50值测定，并以时间为X轴以IC50为Y轴，得出不同时间点IC50值变化曲线(图 5)。
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| 图 5 纳米氧化铜作用于CHO细胞不同时间点IC50值变化曲线 |
图 5中X轴为不同时间点，起始点为加入受试物作用1 h后所测得IC50。本操作程序设置，加入受试物后前3 h，每小时计算1次，此后每3 h计算1次。加入受试物后，前3 h IC50值较高，随着时间延长呈现明显下降趋势。作用6 h后IC50值曲线基本稳定，持续在低于1.0 mg/mL以下，证明纳米氧化铜染毒后3~6 h期间为发挥毒性作用的起始点。
作用时间达到15 h后，IC50数值接近，作用时间延长到45 h以后，IC50值又呈现略有升高趋势。
3 讨论本研究中纳米氧化铜粒子仅为40 nm，由于其具有小尺寸效应、接口效应、量子效应和量子隧道效应[5]等特点，作用于细胞时可能产生与化学物质不同的细胞毒性作用，按传统的毒性测定方法无法了解毒性作用的起始时间以及随着时间的变化精确的毒性变化效应，可能会忽略纳米材料作用于细胞的毒性效应中间变化过程。本研究通过RTCA方法对纳米氧化铜作用于CHO细胞所产生的毒性作用进行整体的精确分析。RTCA实时细胞分析系统是近些年来发展并快速成熟的新型细胞活性检测方法，已被国际上众多研究机构认可并应用[8-10]，该技术基于微电子阻抗技术，可以对细胞数量、细胞的大小、形状、伸展及细胞的粘附力等一系列特征进行检测。其特点在于，可以对细胞进行无标记实时监测，在同一批细胞不改变培养环境的条件下对连续的时间点进行数据分析；在细胞毒性研究中，可以清晰地呈现出细胞的毒性起始时间点及整个毒性效应过程[10-11]。在RTCA分析系统中，采用无量纲细胞指数CI值，定量评价一系列细胞特征，如细胞数量、细胞活性、粘附程度、细胞形态等[12]。
本实验过程中，首先以不同密度CHO细胞在正常培养条件下进行生长曲线的测定，根据染毒时间需求选择适宜的细胞密度。细胞密度为5×103个/孔时，细胞拟染毒起始时间(细胞接种于孔中约24 h)到整个毒性研究过程结束(染毒后48 h)均处于对数生长期，作为细胞毒性研究的最适细胞接种密度，保证了后期毒性研究的精确性。
细胞毒性效应实验结果显示，染毒后各剂量组细胞变化曲线波动较大，且基本一致，说明由于受试物的加入，细胞与受试物正处于相互适应阶段，虽然波动较大，但所有剂量组趋势一致，并非纳米氧化铜所产生的毒性作用。此后，各剂量组趋势有所区分，且走向基本稳定。纳米氧化铜作用于CHO细胞3 ~ 6 h期间迅速产生毒性效应，且随着时间延长，毒性效应增强。说明染毒3 h以后是毒性作用的起始时间。作用6 h后，IC50值持续在低于1 mg/mL以下，且呈持续降低趋势，即毒性作用持续增强，作用时间达到15 h后，毒性作用接近稳定。因此，在纳米氧化铜对CHO细胞所产生毒性作用的进一步研究工作中，对染毒后3 ~15 h所产生的毒性作用进行研究更有意义。
此外，本实验染毒剂量为0.0313、0.0625l和0.125 mg/mL，较低剂量组出现明显的染毒后细胞活性下降，之后细胞又继续生长的现象。一般认为纳米材料的毒性与颗粒的大小、表面积、化学成份等因素有关。氧化铜混悬于DMEM等培养基中时可能会释放出铜离子[13]，而且氧化铜颗粒可能在被细胞摄入后进入到溶酶体中，在酸性环境下释放铜离子[14]，铜离子可以通过结合DNA而导致细胞毒性[15]。因此推测，纳米氧化铜染毒后，可能进入细胞，释放出铜离子与细胞DNA结合。而较低染毒剂量组，其纳米氧化铜含量低，全部与细胞结合之后，余下未结合细胞不再受纳米氧化铜影响而继续生长，而染毒剂量较高则出现持续的细胞毒性。但纳米氧化铜的作用机制还需进一步研究以得到明确解释，此实验结果可以作为参考从而进行深入研究。
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