2003年4月，Service[1]讨论了纳米材料的生物效应及其对环境、健康的影响问题。欧盟在推出《关于化学品注册、评估、许可和限制法规》(《REACH法规》)时，已将纳米材料的安全性问题列入重点研究议程，我国已将纳米生物安全性研究列入国家“973”重点基础研究规划，纳米对环境以及生物体可能产生的影响越来越受人们的关注，利用“绿色化学”制备纳米材料也得到了国内外研究者的重视。研究表明[2-4]利用微生物、酶和一些植物等纯天然原料，制备纳米材料，方法简单且无污染。
随着纳米医学的研究深入，探索作为纳米粒子应用研究热点之一的金纳米绿色合成方法，将对其在生物方面的广泛应用起到较大的推动作用。本研究在生物缓冲体系4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES中合成新型纳米金颗粒，对该法制得的金纳米颗粒进行细胞毒性评价，为其进一步的生物学应用提供一定的实验依据。
1 材料、试剂和仪器 1.1 材料细胞选择ISO规定的小鼠成纤维结缔组织细胞(L-929细胞)。
1.2 试剂与仪器HEPES(C8H18N2O4S，香港FARCO CHEMICAL SUPPLIES)；氯金酸溶液(AuCl3 ·HCl ·4H2O)(上海第一试剂厂)；MTT、ROS试剂盒(江苏海门碧云天试剂公司)；DMEM培养基(美国Gibco公司)；UV-2450紫外分光光度计(日本岛津公司)；日本JEM-1230透射电子显微镜(日本电子公司)；XDS-1B倒置显微镜(上海精密仪器仪表有限公司)；ELX-800型全自动定量绘图酶标仪(美国Bio-Tek公司)；FACS-Callibur流式细胞仪(美国BD公司)。
2 方法 2.1 HEPES中合成GNPs所有需使用的玻璃器皿都在重铬酸钾溶液中浸泡过夜，然后用去离子水冲洗干净，烘干备用。氯金酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)及所使用的Mini-pore纯水均用0.22 μm膜过滤。将100 mL浓度为2.5×10-5mmol/L氯金酸加入到三颈烧瓶中，加热至微沸，在快速搅拌下，迅速加入1 mL浓度为1.0 × 10-2 mmol/L HEPES保持微沸，观察到溶液由无色变蓝紫色再变酒红色，随后酒红色越来越透亮。10 min后，将三颈烧瓶移至恒温磁力搅拌器，调整转速，不加热，搅拌10 min左右，调整金胶溶液的体积，制得100 μg/mL的纳米金颗粒水溶胶。
2.2 GNPs的形态观察采用日本JEM-1230透射电子显微镜对该工艺下的GNPs进行表征。
2.3 含不同浓度GNPs的DMEM的配置使用Zeiss过滤器加压过滤GNPs，在DMEM中添加不同体积的无菌100 μg/mL GNPs，配置成5组不同浓度的培养基。a组：含有5.0 μg/mL GNPs的DMEM组(取5 mL无菌的100 μg/mL GNPs，用DMEM定容至100 mL)；b组：含有10.0 μg/mL GNPs的DMEM组(取10 mL无菌的100 μg/mL GNPs，用DMEM定容至100 mL)；c组：含有15.0 μg/mL GNPs的DMEM组(取15 mL无菌的100 μg/mL GNPs，用DMEM定容至100 mL)；d组：含有20.0 μg/mL GNPs的DMEM组(取20 mL无菌的100 μg/mL GNPs，用DMEM定容至100 mL)；e组：含有25.0 μg/mL GNPs的DMEM组(取25 mL无菌的100 μg/mL GNPs，用DMEM定容至100 mL)；f组：GNPs组(取50 mL无菌的100 μg/mL GNPs，用0.22 μm膜过滤的Milli-pore纯水定容至100 mL)。
2.4 GNPs的紫外光学特征采用UV-2450紫外分光光度计，对该工艺下的GNPs进行表征。以DMEM为参比。
2.5 细胞培养复苏冻存的L-929细胞经过传代，生长情况稳定后经胰蛋白酶消化，调整细胞浓度约1×105/mL，加入到含不同浓度GNPs的培养基中，接种细胞于96孔培养板，每组8孔，每孔150 μL，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。
2.6 MTT测定于24、48和72 h后各取出1块培养板，依试剂盒法操作，采用酶标仪在490 nm波长处测定各孔吸光度值(A值)，并计算出各组的均值。
2.7 ROS测定于72 h后取出1块培养板，依照试剂盒法操作，流式细胞仪检测。
2.8 主要观察指标① 透射电镜观察GNPs的形态、粒径、分散度；② 紫外分光光度计观察GNPs的紫外光学特征；③ 采用倒置相差显微镜观察细胞形态；用酶联免疫检测仪测定溶液吸光度值来评估GNPs对细胞生长的影响。
3 结果 3.1 GNPs的形态观察及透射电镜表征本实验中所制备的纳米金胶呈现透亮的酒红色。透射电子显微镜下观察，可见，合成的纳米金粒子为球型，分散均匀(图 1-A)，通过Image-pro plus version 6.0软件测量，得出95%合成的纳米金粒径在16~34 nm之间，粒径均一，平均直径约为24 nm(图 1-B)。
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| 图 1 GNPs透射电子显微镜图及纳米金粒径分布 |
3.2 含不同浓度GNPs的DMEM紫外图谱
各组培养基的最大吸收波长没有明显变化，均在525 nm附近(图 2)。表明GNPs的粒径没有发生变化，随着GNPs浓度的升高，峰高上升。
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| 图 2 含不同浓度GNPs的DMEM紫外吸收光谱 |
3.3 各组细胞在倒置显微镜下的形态
A(如图 3-A)、B(如图 3-B)、C(如图 3-C)GNPs试验组细胞形态良好，细胞呈梭形或星形，细胞折光性强，与空白对照组(图 3-F)相似。D(如图 3-D)、E(如图 3-E)GNPs试验组细胞融合度较低，细胞分泌物增多。
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| 图 3 倒置相差显微镜下观察细胞生长72 h的形 |
3.4 不同时间各组的吸光度值、细胞相对增殖率及毒性分级结果
细胞毒性评级标准参考ISO-10993-5。24、48 h时培养基中纳米金浓度为5、10和15 μg/mL时，毒性等级为0；当纳米金浓度为20和25 μg/mL时，毒性等级为1。72 h时培养基中纳米金浓度为5和10 μg/mL时，毒性等级为0；纳米金浓度为15和20 μg/mL时，毒性等级为1；纳米金浓度为25 μg/mL时，毒性等级为2(表 1、表 2)。可见用HEPES还原氯金酸得到的GNPs具有良好的生物相容性。
| 组别/(μg/mL) | 吸光度值(x±s) | ||
| 24 h | 48 h | 72 h | |
| 0 GNPs (DMEM) | 0.483 6±0.011 0 | 0.669 0±0.013 9 | 0.970 1±0.014 2 |
| 5 GNPs | 0.492 8±0.013 1 | 0.709 9±0.013 9 | 0.978 4±0.018 6 |
| 10 GNPs | 0.493 0±0.008 8 | 0.710 3±0.011 4 | 0.971 1±0.016 1 |
| 15 GNPs | 0.493 1±0.016 9 | 0.697 3±0.012 6 | 0.954 1±0.023 1 |
| 20 GNPs | 0.443 9±0.019 3** | 0.636 7±0.014 5** | 0.860 1±0.026 0** |
| 25 GNPs | 0.405 3±0.020 6** | 0.548 6±0.020 0** | 0.704 9±0.020 6** |
| 注：试验组与阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01 | |||
| 组别/(μg/mL) | 24 h | 48 h | 72 h | |||||
| RGR/% | 毒级 | RGR/% | 毒级 | RGR/% | 毒级 | |||
| 0 GNPs (DMEM) | 100.00 | 0 | 100.00 | 0 | 100.00 | 0 | ||
| 5 GNPs | 101.90 | 0 | 106.11 | 0 | 100.86 | 0 | ||
| 10 GNPs | 101.94 | 0 | 106.17 | 0 | 100.10 | 0 | ||
| 15 GNPs | 101.96 | 0 | 104.23 | 0 | 98.35 | 1 | ||
| 20 GNPs | 91.79 | 1 | 95.16 | 1 | 88.67 | 1 | ||
| 25 GNPs | 83.81 | 1 | 82.00 | 1 | 72.67 | 2 | ||
3.5 不同浓度GNPs对L-929细胞ROS的影响
细胞内活性氧(ROS)水平对细胞的新陈代谢有着重要的影响。实验结果(图 4)表明：GNPs作用72 h后，各组细胞ROS水平随着培养基中GNPs含量的升高而降低。
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| 图 4 各组ROS水平 |
4 讨论
HEPES含O-S及O=S结构，与羟基、巯基、醇硫盐一样，有一定的还原作用；做为一种氢离子缓冲剂，HEPES可以提供H+，而H+也有一定的还原能力；另外HEPES含有的哌嗪环结构，也是其能将氯金酸还原得到纳米金的重要原因之一[5-6]。用HEPES配制成溶液，作为还原剂，成分简单，无需添加其他稳定剂或分散剂，而且是相对绿色的合成方法。
本实验设计了不同梯度浓度的纳米金对L-929细胞的生长影响，统计结果显示用HEPES还原氯金酸得到的纳米金具有良好的生物相容性。HEPES制备金纳米材料可以提高纳米粒子的生物兼容性，合成具有高生物亲和力、稳定的纳米金，同时保持原有的特有性质，为其进一步在生物医学领域的应用提供一定的实验依据，也特别适应目前单细胞发展的需要。
纳米科技是一把“双刃剑”，在带给人们精神和物质利益的同时，尤其要注意其对人类健康和环境的潜在威胁。在利用新技术的同时要让人类和环境在和谐的环境中获得可持续的发展[1]。
| [1] | Service RF. Nanomaterials show signs of toxicity[J]. Science, 2003, 300(11): 243. |
| [2] | Huang JL, Li QB, Sun DH. Biosynthesis of silver and gold nanoparticles by novel sundried Cinnamomum camphora leaf[J]. Nanotechnology, 2007, 18(10): 105104:1–11. |
| [3] | Song JY, Kim BS. Rapid biological synthesis of silver nanoparticles using plant leaf extracts[J]. Bioprocess Biosyst Eng, 2009, 32(1): 79–84. doi: 10.1007/s00449-008-0224-6 |
| [4] | Huang JL, Li QB, Sun DH. Biosynthesis of silver and gold nanoparticles by novel sundried Cinnamomum camphora leaf[J]. Nanotechnology, 2007, 18(10): 1–11. |
| [5] | Rajesh S, Alison MF, Paul M, et al. Murray gold nanoparticles:past, present, and future[J]. Langmuir, 2009, 25(24): 13840–13851. doi: 10.1021/la9019475 |
| [6] | Xie J, Lee JY, Wang DIC. Seedless, surfactantless, high-yield synthesis of branched gold nanocrystals in HEPES buffer solution[J]. Chem Mater, 2007, 19(11): 2823–2830. doi: 10.1021/cm0700100 |