纳米氧化石墨烯对小鼠心肌氧化损伤作用

Download PDF 打印本文

引用本文

刘艳, 王硕, 吴冠宇, 赵淑华. 纳米氧化石墨烯对小鼠心肌氧化损伤作用[J]. 环境卫生学杂志, 2015, 5(3): 206-210. 复制到剪切板

LIU Yan, WANG Shuo, WU Guanyu, ZHAO Shuhua. Effect of Nano Graphene Oxide on Oxidative Injury of Mice Myocardium[J]. Journal of Environmental Hygiene, 2015, 5(3): 206-210. 复制到剪切板

纳米氧化石墨烯对小鼠心肌氧化损伤作用

刘艳, 王硕, 吴冠宇, 赵淑华

吉林省吉林大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生教研室

作者简介: 刘艳, 硕士, 从事环境因素与健康研究

通信作者: 赵淑华, 硕士生导师, 从事环境因素与健康研究; Email: shzhao@jlu.edu.cn

联系方式: 长春市新民大街1163号; 邮编:130021; Email: liuyan13@mails.jlu.edu.cn

摘要: 目的观察纳米氧化石墨烯对小鼠心肌的氧化损伤作用。方法选择80只健康ICR小鼠, 雌雄各半, 随机分成4组, 将纳米氧化石墨烯在无菌条件下溶于灭菌高纯水中, 分别以剂量为0、0.35、0.7和1.40 mg/kg的纳米氧化石墨烯进行尾静脉注射1次。于注射后3 d和15 d分别处死40只小鼠, 取心肌, 测定心肌组织匀浆中丙二醛(MDA)的水平、总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力、超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果注射后3 d, 雌、雄各剂量组MDA含量高于对照(P < 0.05);雄性高剂量组T-AOC显著低于其他组(P < 0.05);雌、雄小鼠各剂量组SOD活性均显著高于对照组(P < 0.05), 雌性小鼠具有剂量-效应关系; 雌、雄小鼠GSH-Px各剂量组均低于对照组(P < 0.05)。染毒后15 d, 雌性和雄性小鼠中、高剂量组MDA仍明显高于对照组(P < 0.05);雄性中、高剂量组T-AOC显著低于对照组和低剂量组(P < 0.05), 雌性各剂量明显低于对照组(P < 0.05);雌、雄小鼠SOD活性随剂量而增高(P < 0.05), 雌性各剂量组均明显高于对照组(P < 0.05);雌、雄小鼠各剂量组GSH-Px活性显著低于对照组(P < 0.05)。结论未经修饰的纳米氧化石墨烯经尾静脉注射后可能对心肌产生脂质过氧化损伤作用。

关键词: 纳米氧化石墨烯氧化损伤心肌

Effect of Nano Graphene Oxide on Oxidative Injury of Mice Myocardium

LIU Yan, WANG Shuo, WU Guanyu, ZHAO Shuhua

Abstract: Objective To observe the oxidative injury of myocardium in mice induced by nano graphene oxide. Methods Eighty healthy male and female ICR mice were randomly divided into four groups. Nano grapheme oxide was dissolved in sterile pure water under aseptic conditions, and it was injected intravenously only for once; the dose for each group was 0, 0.35, 0.70 and 1.40 mg/kg, respectively. Forty mice were sacrificed 3 days and 15 days after the injection, and the heart muscle of mice was collected to measure malondialdehyde (MDA) levels, total antioxidant capacity (T-AOC), the activities of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px). Results At 3 days after injection, the levels of MDA in all nano grapheme oxide groups were higher than that in the control group both in male and female mice (P < 0.05); T-AOCs in high dose groups were obviously lower than that in other groups(P < 0.05); SOD activities in all nano grapheme oxide groups were higher than that in the control group both in male and female mice (P < 0.05) and a dose-effect relationship was shown in female mice; the activities of GSH-Px in all nano grapheme oxide groups were higher than that in the control group (P < 0.05). At 15 days after injection, MDA contents in the middle and high dose groups were higher than that in the control group both in male and female mice (P < 0.05); T-AOCs in the middle and high dose male groups were obviously lower than that in the control and low dose male groups (P < 0.05), T-AOCs in all nano grapheme oxide female groups were lower than that in the control group (P < 0.05); the activities of SOD in all nano grapheme oxide groups were higher than that in the control group (P < 0.05) and were rising with the dose of nano grapheme oxide in male and female mice (P < 0.05); the activities of GSH-Px in all nano grapheme oxide groups were higher than that in the control group both in male and female mice (P < 0.05). Conclusion Intravenous injection of unmodified nano grapheme oxide might induce lipid peroxidation injury of myocardium in mice.

Key words: nano graphene oxide oxidative damage myocardium

氧化石墨烯是近年来新兴的纳米材料，呈现单层碳原子以sp²杂化形式存在的二维(2D)蜂窝状晶格结构^[1]。由于其体积小、比表面积大、固有光学特性、能与芳香族药物分子很好的共价结合等特点，使氧化石墨烯成为一种在生物医药领域具有广泛应用前景的新型材料^[2]。目前，氧化石墨烯已应用于药物运载、生物分子的检测、生物成像生物装置设计、分子医学等方面^[3]。氧化石墨烯应用的推广，使其生物安全性也越来越受到人们的关注。Zhang等^[4]对小鼠进行氧化石墨烯的尾静脉注射并运用放射示踪技术和生物剂量测定等，发现氧化石墨烯可在血液循环内滞留较长时间(半衰期5.3±1.2 h)，其被内皮网状系统吸收也较少。研究发现，纳米混悬制剂的静脉注射可减少阻塞毛细管的风险，还可因其被动靶向作用而增强药效，并因静注贮库效应而避免药物瞬间浓度过高而引起的毒性，静脉注射纳米制剂可取得较好的效果^[5]。目前对氧化石墨烯的体内毒理学研究较少，尤其是心肌组织。本研究通过尾静脉注射纳米氧化石墨烯水溶液，分别于3 d和15 d观察心肌受氧化损伤情况，为其作为药物载体应用于临床提供依据。

1 材料及方法 1.1 纳米氧化石墨烯溶液的制备

纳米氧化石墨烯由吉林大学材料学院采用改良Hummers法合成。合成的纳米材料为片状结构，纳米尺寸平均为5 nm。在无菌条件下将新制备的纳米材料溶于灭菌后的高纯水中，现用现配。

1.2 动物分组及处理

选择ICR健康小鼠80只，雌雄各半，体重(20±2) g，由吉林大学基础医学动物部提供。根据预实验结果(纳米氧化石墨烯溶液经尾静脉注射，小鼠的LD₅₀约为5.657 mg/kg)将80只成年清洁级ICR小鼠，雌雄各随机分为4组，分别为对照组(高纯水)和低剂量组(0.35 mg/kg，即1/16 LD₅₀)、中剂量组(0.70 mg/kg，即1/8 LD₅₀)和高剂量组(1.40 mg/kg，即1/4 LD₅₀)，采用一次性尾静脉注射方式，注射容积为10 mL/kg，注射速度约为0.02 mL/s。

1.3 测定指标及测定方法

于染毒后3 d和15 d，小鼠脱臼处死，取心脏称重，并计算脏器系数。按照1：9的比例加生理盐水，冰浴下匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清，测定丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)以及总抗氧化能力(T-AOC)。

1.4 主要试剂及仪器

丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒、总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

FA1004型上皿电子天平(上海天平仪器厂)、WS2-261-79型电热恒温水温箱(北京医疗设备厂)、小型三用水浴箱(北京西城区医疗器械厂)、722型光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂制造)，TD5A台式自动平衡离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)、高速冷冻离心机(美国Thermo公司)。

1.5 统计学方法

实验结果以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 17.0软件对测定结果进行单因素方差分析，以1个对照组与3个实验组间均数两两比较进行统计。检验水准α=0.05。

2 结果 2.1 一般情况

尾静脉注射后各组小鼠无死亡。低剂量组注射后活动明显减少，约5~10 min后恢复正常；中、高剂量组小鼠注射后活动减少，继而出现抽搐、步态不稳，约30 min后恢复正常。

2.2 小鼠心脏脏器系数的变化

小鼠心脏脏器系数影响见表 1。注射后3 d，雄性各组间有统计学意义(F=3.88，P=0.033)，中、高剂量组的心脏脏器系数显著低于对照组和低剂量组；雌性各组间有统计学意义(F=4.705，P=0.015)，各剂量组均显著低于对照组(P < 0.05)，但各剂量组之间无统计学意义(P > 0.05)。注射后15 d，雄性小鼠脏器系数各组间(F=1.131，P=0.366) 和雌性小鼠各组间(F=1.249，P=0.325) 均无统计学意义。

表 1 各组小鼠心肌脏器系数(x±s)

组别	3 d		15 d
组别	雄性	雌性	雄性	雌性
对照组	0.70±0.05	0.82±0.07	0.56±0.05	0.62±0.06
低剂量组	0.67±0.04	0.80±0.06^a	0.53±0.04	0.56±0.05
中剂量组	0.63±0.06^a	0.78±0.06^a	0.52±0.05	0.58±0.05
高剂量组	0.60±0.05^a	0.68±0.04^a	0.57±0.06	0.61±0.05
注：与对照组比较，^aP < 0.05；与低剂量组比较，^bP < 0.05；与中剂量组比较，^cP < 0.05

表选项

2.3 心肌MDA含量变化

注射纳米氧化石墨烯对心肌MDA含量影响如表 2所示。注射后3 d，雄性小鼠各组间有统计学意义(F=8.8，P=0.002)，雄性各剂量组显著高于对照组(P < 0.05)；雌性MDA含量随注射剂量增加而增加(F=327.656，P=0.000)，呈剂量效应关系。注射后15 d，雄性小鼠间(F=10.193，P=0.001) 和雌性小鼠(F=57.502，P=0.000) 的MDA含量均有明显差异，雌、雄性小鼠中、高剂量组均显著高于对照组(P < 0.05)，且高剂量组均高于中、低剂量组(P < 0.05)，雌性小鼠中剂量组显著高于低剂量组(P < 0.05)。

表 2 各组小鼠心肌MDA含量(x±s，nmol/mgprot)

组别	3 d		15 d
组别	雄性	雌性	雄性	雌性
对照组	0.65±0.07	0.20±0.02	7.45±0.66	5.17±0.73
低剂量组	0.82±0.09^a	0.69±0.06^a	8.26±0.98	5.86±0.6
中剂量组	0.82±0.08^a	0.90±0.09^ab	8.60±0.82^a	8.83±0.53^ab
高剂量组	0.86±0.04^a	1.48±0.02^abc	10.6±1.04^abc	10.92±1.15^abc
注：与对照组比较，^aP < 0.05；与低剂量组比较，^bP < 0.05；与中剂量组比较，^cP < 0.05

表选项

2.4 心肌T-AOC水平的变化

氧化石墨烯对心肌抗氧化能力影响如表 3所示。注射后3 d，雄性小鼠各组间T-AOC活性有统计学意义(F=6.441，P=0.006)，高剂量组明显低于对照及其他各剂量组(P < 0.05)，雌性各剂量组间无统计学意义(F=0.600，P=0.624)。注射后15 d，雄性小鼠各组间有统计学意义(F=15.235，P=0.000)，中、高剂量组明显低于对照组和低剂量组(P < 0.05)；雌性小鼠各组间有统计学意义(F=10.257，P=0.001)，雌性各剂量组均明显低于对照组(P < 0.05)，各剂量组间无统计学意义(P > 0.05)。

表 3 各组小鼠心肌T-AOC水平(x±s，U/mgprot)

组别	3 d		15 d
组别	雄性	雌性	雄性	雌性
对照组	1.59±0.26	1.13±0.14	3.28±0.21	3.92±0.29
低剂量组	1.63±0.32	1.19±0.14	3.02±0.24	3.29±0.25^a
中剂量组	1.58±0.22	1.11±0.07	2.62±0.26^ab	3.33±0.28^a
高剂量组	1.00±0.23^abc	1.13±0.08	2.35±0.25^ab	2.97±0.29^a
注：与对照组比较，^aP < 0.05；与低剂量组比较，^bP < 0.05；与中剂量组比较，^cP < 0.05

表选项

2.5 心肌T-SOD活性变化

氧化石墨烯对心肌T-SOD活性影响如表 4。注射后3 d，雄性小鼠各组间有统计学意义(F=31.181，P=0.000)，各剂量组明显高于对照组(P < 0.05)，高剂量组低于中剂量组(P < 0.05)；注射后15 d，雄性各组间有统计学意义(F=40.947，P=0.000)，高剂量组明显高于其他各组(P < 0.05)，而低剂量组明显低于对照组，中剂量组与对照无统计学意义(P > 0.05)。雌性小鼠在注射后3 d各组间(F=112.26，P=0.000) 和15 d各组间(F=58.272，P=0.000) 均有统计学意义，各剂量组均明显高于对照组(P < 0.05)，并随注射剂量的增加活性逐渐升高(P < 0.05)，呈剂量—效应关系。

表 4 各组小鼠心肌T-SOD活性(x±s，U/mgprot)

组别	3 d		15 d
组别	雄性	雌性	雄性	雌性
对照组	25.24±1.24	22.4±1.74	90.42±3.1	50.68±5.78
低剂量组	37.98±4.05^a	36.64±2.19^a	69.07±6.14^a	62.60±6.74^a
中剂量组	39.67±1.34^a	44.66±3.07^ab	92.90±9.48^b	87.96±6.98^ab
高剂量组	35.37±2.59^ac	51.88±3.34^abc	121.39±9.38^abc	112.63±11.55^abc
注：与对照组比较，^aP < 0.05；与低剂量组比较，^bP < 0.05；与中剂量组比较，^cP < 0.05

表选项

2.6 心肌GSH-Px活性的变化

氧化石墨烯对心肌GSH-Px活性影响如表 5所示。注射后3 d，雌、雄性小鼠各组间GSH-Px活性均具有统计学意义(雄性组F=79.443，P=0.000;雌性组F=45.412，P=0.000)，雌、雄性小鼠各剂量组显著高于对照组(P < 0.05)，且雄性高剂量组显著低于中、低剂量组(P < 0.05)；雌性小鼠各剂量组间无统计学意义(P > 0.05)。注射后15 d，雌、雄性小鼠各组间GSH-Px活性均具有统计学意义(雄性组F=56.931，P=0.000；雌性组F=27.738，P=0.000)，雌、雄性小鼠各剂量组显著低于对照组(P < 0.05)，且高剂量组均显著低于低、中剂量组(P < 0.05)。

表 5 各组小鼠心肌GSH-Px活性(x±s，U/mgprot)

组别	3 d		15 d
组别	雄性	雌性	雄性	雌性
对照组	37.15±1.87	22.48±1.76	449.81±26.28	395.33±28.79
低剂量组	30.91±2.09^a	15.41±0.80^a	323.47±24.10^a	317.33±33.07^a
中剂量组	30.63±2.76^a	15.24±0.59^a	322.77±17.42^a	305.29±21.3^a
高剂量组	18.15±1.20^abc	14.87±1.34^a	266.44±23.18^abc	240.43±23.13^abc
注：与对照组比较，^aP < 0.05；与低剂量组比较，^bP < 0.05；与中剂量组比较，^cP < 0.05

表选项

3 讨论

机体可在缺血、缺氧、辐射等损伤因素地影响下产生大量自由基，在体内堆积会对细胞产生毒性。Manna等^[6]用单炭纳米管暴露在人类角蛋白细胞中，发现可引起氧化压力，造成过氧化氢产物过量堆积，同时消耗抗氧化剂。

活性氧自由基对机体造成的最大损害是脂质过氧化。MDA是脂质过氧化物的产物中的一种，与膜中蛋白结合引起蛋白质分子内和分子间交联，与蛋白质分子发生聚合^[7]。本研究中，MDA含量在3 d时，雌、雄各剂量组均高于对照组，且雌性小鼠呈现剂量—效应关系，15 d时，雌性和雄性小鼠在中、高剂量组仍明显高于对照组，且均呈现剂量—效应关系，表明纳米氧化石墨烯注射后，心肌发生了脂质过氧化，且持续时间达2周以上。

SOD是生物体内最佳且最重要的自由基清除剂，SOD可催化超氧阴离子自由基歧化为过氧化氢^[8-9]。本研究中，注射3 d后，雌性和雄性各剂量组均高于对照组，且雌性在3 d及15 d均呈现剂量效应关系，雄性各剂量组在15 d逐渐增高。GSH-Px是生物机体内一种重要的抗氧化酶，可清除过氧化氢和氢过氧化物，阻断氧自由基对机体的进一步损伤^[10]。本研究中，染毒后3 d和15 d，各剂量组GSH-Px均低于对照组，可能与心肌产生的脂质过氧化产物有关，也可能纳米氧化石墨烯或其产物对GSH-Px的直接作用，其机制有待进一步研究。

T-AOC由SOD、GSH-Px、CAT等酶促和Vc、V_E等非酶促防御体系共同组成。正常生理状态下，机体有足够的抗氧化剂保护机体对抗活性氧产生并清除自由基^[11]。染毒后3 d，雄性中、高剂量组明显低于其他组，而雌性组则无差异。染毒后15 d，雌、雄各组均低于对照组，表明纳米氧化石墨烯注射后，发生脂质过氧化作用，组织动用各种抗氧化物质来对抗自由基，随着纳米颗粒的累积造成的损伤持续，抗氧化能力有所下降。

本实验中，注射3 d时，雌性和雄性小鼠的心脏脏器系数均明显低于对照组，15 d后均与对照组无明显差异。

LD₅₀通常作为判定毒性较稳定的剂量而被广泛用于药物临床试验中^[12]，纳米材料作为药物载体，其载药率较高^[3]，在临床应用中可能使用的剂量较低。本实验结果可为纳米氧化石墨烯的安全应用提供参考依据。

综上所述，未经修饰的纳米氧化石墨烯经尾静脉注射后可能对心肌产生脂质过氧化损伤作用。

参考文献

[1]	Geim AK, Novoselov KS. The rise of graphene[J]. NatMater, 2007, 6(3): 183–191.

[2]	Sun XM, Liu Z, Welsher K, et al. Nano-graphene oxide for cellular imaging and drug delivery[J]. Nano Res, 2008, 1(3): 203–212. doi: 10.1007/s12274-008-8021-8

[3]	程相阵, 周毅, 姜再兴, 等. 氧化石墨烯载药性能和生物安全性研究现状[J]. 生物医学工程与临床, 2012, 16(4): 402–405.

[4]	Zhang XY, Yin JL, Cheng P, et al. Distribution and biocompatibility studies of graphene oxide in mice after intravenous administration[J]. Carbon, 2011, 49(3): 986–995. doi: 10.1016/j.carbon.2010.11.005

[5]	袁慧玲, 易加明, 张彩云, 等. 纳米混悬剂的制备方法及给药途径研究进展[J]. 中国新药杂志, 2014, 23(3): 297–301.

[6]	Manna SK, Sarkar S, Berry J, et al. Single-walled carbon nanotube induces oxidative stress and activates nuclear transcription factor-B in human keratinocytes[J]. Nano Letters, 2005, 5(9): 1976–1984.

[7]	张永峰, 殷波. 混合盐碱胁迫对苗期紫花苜蓿抗氧化酶活性及丙二醛含量的影响[J]. 草业学报, 2009, 18(1): 46–50. doi: 10.11686/cyxb20090107

[8]	陈鸿鹏, 谭晓风. 超氧化物歧化酶(SOD)研究综述[J]. 经济林研究, 2007, 25(1): 59–65.

[9]	朱秀敏. 超氧化物歧化酶的生理活性[J]. 当代医学, 2011, 17(15): 26–27. doi: 10.3969/j.issn.1009-4393.2011.15.017

[10]	王咏梅. 自由基与谷胱甘肽过氧化物酶[J]. 解放军药学学报, 2005, 21(5): 369–371.

[11]	张慧, 苏全生. 联合抗氧化剂对一次大强度运动后运动员T-AOC、SOD、GSH-Px及MDA的影响[J]. 北京体育大学学报, 2008, 31(4): 483–485.

[12]	郭晨龙. Ⅰ期临床试验研究概述[J]. 黑龙江医药, 2009, 22(6): 809–815.

DOI: 10.13421/j.cnki.hjwsxzz.2015.03.005
中国疾病预防控制中心主办。

刘艳, 王硕, 吴冠宇, 赵淑华

LIU Yan, WANG Shuo, WU Guanyu, ZHAO Shuhua

纳米氧化石墨烯对小鼠心肌氧化损伤作用

Effect of Nano Graphene Oxide on Oxidative Injury of Mice Myocardium

环境卫生学杂志, 2015, 5(3): 206-210

Journal of Environmental Hygiene, 2015, 5(3): 206-210

DOI: 10.13421/j.cnki.hjwsxzz.2015.03.005

相关文章

工作空间