壬基酚(NP)是环境内分泌干扰物中的一种，也被联合国UNEP列为27种持久性有毒化学物之一。本课题组前期研究发现NP会干扰多种动物的内分泌系统，有报道NP对中枢神经系统功能和组织都有毒性作用，特别是在脑发育的重要时期影响脑的发育，导致认知行为受到影响^[1]。近年来的研究表明，世界各地的水、土壤都受到不同程度的污染，蔬菜，特别是叶类蔬菜中NP的检出率是100%^[2]，检出的质量浓度范围是1.26~8.58 μg/kg。NP的广泛应用和严重的污染对NP的研究变得紧迫。本课题组前期研究表明NP可导致仔鼠神经行为改变和学习记忆下降^[3]，目前原因未知。

尼氏体是胞质内的一种嗜碱性物质，广泛见于各种神经元，主要功能是合成蛋白质，如细胞中的某些成分的更新以及产生神经递质、相关的蛋白质和酶类，是神经活动时所需物质。轴突蛋白质大多来自胞体的尼氏体，神经元在兴奋传导过程中，不断消耗某些蛋白质物质，尼氏体可合成新的蛋白质以补充这种消耗^[4]。本实验拟通过观察尼氏体的改变来初步探讨NP对神经的损伤。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 实验动物

清洁级SD大鼠60只(动物合格证号：SCXK(渝)20070005)，按雌:雄=2 :1的比例同笼交配获取孕鼠28只，根据怀孕时间进行随机分组，即每天怀孕的大鼠随机分成4组，直到获取28只孕鼠，分别在怀孕后8~14 d灌胃0、50、100、200 mg/(kg ·d)(英文标记分别为C、L、M、H组)的NP，喂养在白昼交替各12 h，实验室自然通风。

1.1.2 实验试剂

二甲苯、浓度为100%、95%、90%、85%、75%的酒精、蒸馏水、苏木染液、盐酸酒精、氨水溶液、伊红染液、中性树胶、甲苯胺蓝溶液，NP浓度为99%、4%多聚甲醛等。

1.1.3 实验器材

脱水机(武汉俊杰电子有限公司，型号JJ-12J)、包埋机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，型号KD-BM)、切片机(上海莱卡仪器有限公司，型号RM2016)、冻台(武汉俊杰电子有限公司，型号JB-L5)、摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，型号KD-P)、烤箱(上海福玛实验仪器有限公司，型号DGX-9003B)。

1.2 方法

仔鼠脑皮质切片脱水和浸蜡包埋后分别进行HE染色和尼氏染色，然后每组内每张切片在皮质部随机挑选3个200倍视野拍照，然后测积光密度值，积光密度值越大，阳性表达越强。

1.2.1 脱水和浸蜡包埋步骤

① 75%酒精中脱水4 h；② 85%酒精中脱水2 h；③ 90%酒精中脱水1.5 h；④ 95%酒精中脱水1 h；⑤ 100%酒精Ⅰ中脱水30 min；⑥ 100%酒精2中脱水30 min；⑦ 无水乙醇二甲苯中5~10 min；⑧ 二甲苯Ⅰ中5~10 min；二甲苯Ⅱ中透明5~10 min；⑨ 石蜡Ⅰ中浸蜡1 h；石蜡Ⅱ中浸蜡1 h；石蜡Ⅲ中浸蜡1 h；⑩ 包埋机包埋。

1.2.2 HE染色步骤

① 二甲苯Ⅰ中脱蜡10 min；二甲苯Ⅱ中脱蜡10 min；② 100%酒精Ⅰ中脱二甲苯5 min；100%酒精Ⅱ中脱二甲苯5 min；95%酒精中浸泡5 min；85%酒精中5 min；75%酒精中浸泡5 min；蒸馏水中洗去酒精5 min；③ 苏木素染色3~8 min，流水稍冲洗；④ 1%盐酸酒精溶液分化30 s(观察分化效果)，流水稍冲洗；⑤ 1%氨水溶液返蓝30 s，流水稍冲洗；⑥ 镜检着色满意后入伊红染液染色1~3 min；⑦ 95%酒精Ⅰ中脱水5 min；95%酒精Ⅱ中脱水5 min；100%酒精Ⅰ中脱水5 min；100%酒精Ⅱ中脱水5 min；⑧ 二甲苯Ⅰ中5 min；二甲苯Ⅱ中10 min；⑨ 中性树胶封片。

1.2.3 尼氏染色步骤

① 制作好的石蜡切片脱蜡至水中(HE中1~8步)；② 入1%甲苯胺蓝溶液，常温染10~30 min；③ 用75%、90%、100%梯度酒精依次脱水，每次5 min，在镜下控制分色效果，结果可见尼氏小体深蓝色颗粒，细胞核呈淡蓝色；④ 切片晾干后中性树胶封固。

1.3 统计学处理

用SPSS 18.0进行数据分析，结果描述以均数±标准差表示，数据分析采用单因素方差分析，检验水准定为0.05，以P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 染色与数据分析 2.1 HE染色

仔鼠染毒低剂量皮质区神经元开始出现固缩，随着剂量的升高，皮质区神经元层次出现紊乱，排列稀疏散乱，脱失明显，细胞体积明显缩小，核深染(图 1)。

2.2 尼氏染色

随着NP浓度增加，尼氏小体的数量相对减少，且分布不均，形状大小不一，染色的深浅、透明度也不一致(图 2)。

2.3 光密度值

脑皮质中尼氏小体的光密度值随着染毒剂量的增加均有不同程度的降低。与对照组比较，低剂量组差异无统计学意义(P > 0.05)，中、高剂量组有统计学差异(P < 0.05；表 1)。

3 讨论

NP是一种脂溶性物质，具有富集性，虽然日常生活中接触的量很少，但因为生物富集的作用使其在体内的浓度增加，导致对机体的损伤。而且因为大脑脂肪含量高，所以NP在脑中因富集作用可致含量较高，对中枢神经系统的影响就比外周的生殖系统更为敏感^[5]。孕哺期暴露在NP中的雄性仔鼠脑皮质TNF-α表达增加，会影响脑皮质的正常功能^[6]。NP对母体的毒性可能会通过胎盘屏障、血脑屏障、干扰下丘脑—垂体—性腺轴的调节功能等途径导致仔鼠神经系统的发育延缓、学习记忆水平降低^[7]。但目前关于NP神经毒性的机制研究较少。

尼氏染色中尼氏体清晰可辨，胞核、核仁也非常清晰，尼氏染色中尼氏体受染后呈块状(形如虎斑)或颗粒状，核周围尼氏体颗粒较大，近边缘处较小而细长，在机体正常生理状态下尼氏体大而数量多，反映神经细胞合成蛋白质的功能较强，在神经元受损时，尼氏体的数量可减少甚至消失。未见由尼氏体的形态数目变化来观察神经元细胞的损伤，本研究从尼氏体的角度来研究壬基酚的神经毒性。

通过对脑组织形态学染色后，明显观察到染毒高剂量组的神经元明显减少。在HE染色中可以看到高剂量组与对照组比较，其脑皮质神经元细胞深染、缩小、排列紊乱，说明壬基酚对老鼠产生了大脑神经损害。在尼氏染色中，可以清晰的看到染色变浅、尼氏小体数量减少、排列不规则，推测壬基酚对神经系统的损害作用很可能是NP的毒性作用导致脑组织形态结构的改变，最终导致神经功能障碍。