砷可以通过胎盘屏障或血脑屏障在脑组织中蓄积，从而影响儿童脑发育和神经递质合成和分泌，对儿童智力及神经系统的正常发育产生不良影响^[1]，其中一个主要表现就是学习记忆减退^[2]，但其毒性作用机制仍处于研究阶段。由德国神经生物学家Barde于猪脑中发现的脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)主要分布在大脑皮质、海马组织等部位，对学习记忆有促进作用^[3]。本研究通过观察砷暴露后大鼠海马区BDNF的表达，初步探索砷致学习记忆损害的可能机制，为预防和治疗砷神经毒性引起的中毒提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂

Real-Time PCR检测系统(杭州博日科技有限公司)、紫外分光光度仪(日本Shimadzu公司)、凝胶成像系统(法国Mat公司)、微波消解仪(ETHOS A)、电感耦合等离子体发射光谱仪(VISTA-MPS SPECTROME)。

亚砷酸钠(分析纯，上海晶纯试剂有限公司)、砷标准应用液(1 000 μg/L，国家标准物质研究中心)、SYBR Premix Ex Taq试剂盒(Takara公司)、TriZol试剂盒(美国Invitrogen公司)、M-MLV试剂盒(杭州沃森生物技术有限公司)、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)、脑源性神经营养因子酶联免疫分析(ELISA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 动物分组及处理

选择健康清洁级4—6周龄SD大鼠40只，雌雄各半，体重在100 + 20 g(由贵阳医学院动物实验中心提供，实验设施合格证编号为SYXK(黔)2012-001，动物合格证编号为SCXK(黔)2012-001，实验经贵阳医学院伦理委员会批准实施，编号为：1307003)，适应性饲养1周后，将大鼠按体重随机分为4组，分别为对照组(蒸馏水)和2.4、12和60 mg/L亚砷酸钠溶液暴露组，即低、中、高剂量组，每组10只大鼠，雌雄各半，每笼5只，分笼饲养。采用自由饮水的方式连续染毒100 d。饲养环境温度为20℃~25℃，湿度为60%~65%。

1.3 样品收集

乙醚麻醉大鼠，颈椎脱臼处死大鼠，断头后迅速取出脑组织，称重，放入装有冰浴生理盐水的培养皿中漂洗，并沿大脑纵裂垂直切为左右两个半球，游离并取出海马组织，称重后分装，储存于-70℃冰箱，备用。

1.4 脑砷含量测定

称取脑组织0.3 g，加入6 mL硝酸和2 mL过氧化氢，放置过夜，次日放入微波消解仪中消解。每次至少有1个样品空白。消解后用去离子水定容至25 mL。采用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP -AES)^[4]测定标准系列和样品的光度值，以标准曲线计算样品中砷的含量。同时消化生物成分分析标准物质茶叶(GBW 10016) 和杨树叶成分分析标准物质(GBW 07604)^[5]，控制消化条件，保证回收率在90%~110%范围内。

1.5 大鼠海马组织BDNF mRNA表达的测定

1.5.1 RNA的提取及逆转录合成CDNA

按TriZol试剂盒进行RNA的提取，按M-MLV试剂盒进行逆转录合成cDNA。

1.5.2 引物设计

使用Primer Express 2.0软件设计引物，以β-actin作为RT-PCR的内参标准。实验引物由北京鼎国昌盛生物科技有限责任公司合成，引物序列见表 1。

1.5.3 实时荧光定量RT-PCR检测

按Takara公司的SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行。PCR反应检测采用BIOER(杭州博日科技有限公司)公司的Real-Time PCR检测系统，PCR反应条件为95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火1 min，40个循环。采用相对定量法比较染毒组与对照组BDNF mRNA表达水平，样品中目的基因相对于内参照基因的拷贝数为2^-ΔCt，Δct=ct(目的基因三次循环平均值)-ct(内参基因三次循环平均值)；染毒组样品的基因表达相对于对照组的变化倍数为2^-ΔΔCt，ΔΔct=Δct染毒组-Δct对照组。

1.6 海马组织BDNF蛋白表达的测定

考马斯亮蓝法测定海马组织总蛋白浓度；ELISA法测定海马组织BDNF蛋白的表达。

1.7 统计方法

采用SPSS 17.0进行统计分析，以α=0.05为检验水准，实验数据以均值±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way-ANOVA)，与对照组比较采用LSD法。

2 结果 2.1 脑砷含量变化

各染毒组大鼠的脑砷含量均较对照组高，并随染毒剂量的增加而升高(P＜0.05;表 1)，差异具有统计学意义。

2.2 大鼠海马组织BDNF表达的测定

2.2.1 海马组织总RNA纯度及完整性鉴定

提取的总RNA电泳可见3条清晰条带，无基因组DNA污染，完整性良好；紫外光检测RNA的纯度，所有样品A260/A280值均在1.8~2.0之间，符合后续实验对RNA质量的要求(图 1)。

2.2.2 BDNF基因扩增效率

将荧光定量RT-PCR产物进行real time PCR，得到BDNF基因的扩增曲线和溶解曲线(图 2，图 3)。BDNF的扩增曲线呈“S”形，表明各基因的动力学曲线整体平行性较好，曲线拐点清楚，基线平无明显上扬趋势。溶解曲线呈单峰状，表明有特异性扩增产物，无引物二聚体及其他非特异性扩增产物。

2.2.3 大鼠海马组织BDNF的表达水平

染毒组海马BDNF mRNA及其蛋白的表达均低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05；表 2)。其中染毒组BDNF mRNA的相对表达量较对照组减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，高剂量组和中剂量组BDNF蛋白表达较对照组、低剂量组低，差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论 3.1 砷暴露量与脑砷的关系

大鼠通过饮水给砷染毒100 d后，脑组织内砷含量增加，并随着染砷浓度增加而增加，这与杨瑞英等^[6]研究结果相符，提示砷能通过血脑屏障在脑组织中蓄积。尽管在大脑皮层、海马组织、基底神经节和下丘脑各区含量不同，但呈现明显的剂量关系^[7]。

3.2 亚慢性砷暴露对BDNF表达的影响

BDNF分子单体是由119个氨基酸残基组成的分泌型成熟多肽，分布在中枢神经系统、周围神经系统、内分泌系统、骨和软骨组织等广泛区域内，但主要是在中枢神经系统内表达，其中海马组织和皮质的含量最高^[8]。BDNF作为神经营养因子家族的一员，不仅能够促进神经干细胞的增殖、迁移和分化，促进多种神经元的存活和生长发育，而且能促进突触的可塑性，改变脑内神经元的形态，增加突触终末的密度和促进树突和轴突的生长^[9]。近年来BDNF越来越受到关注，他参与可塑性机制和长时程增强效应(LTP)的形成和维持。LTP具有时程长和联合的性质，因此不少研究者把LTP与学习和记忆联系起来，认为他是研究学习、记忆的分子模型。BDNF能通过调节突触后NMDA受体、启动MAPK转导等途径参与LTP的机制，影响学习与记忆功能^[10]。宁晓霞等^[11]的研究结果表明BDNF及受体TrkB的表达，与学习记忆能力的程度呈平行的线性关系。相关研究也已证实，BDNF能够调节突触传递易化长时程增强效应(LTP)，在海马组织的LTP中起关键的作用^[12]。这些结果表明海马组织的BDNF的表达对学习记忆能力有重要作用。此外，BDNF还能增加大鼠海马组织胆碱能突触释放乙酰胆碱，BDNF与乙酰胆碱之间存在着正反馈作用，从而对认知功能有保护作用^[13]，用BDNF处理的低密度培养的胚胎胆碱能神经元ChAT酶活力水平可提高2~3倍^[14]。

本研究结果显示，砷暴露组大鼠海马组织BDNF mRNA及蛋白表达均较对照组下降。提示亚慢性砷暴露导致大脑海马组织BDNF表达下调，可能影响大鼠学习记忆能力。本课题组前期研究^[15]已表明，砷暴露引起大鼠海马组织AChE活性升高，导致乙酰胆碱含量下降。由此推测BDNF下调也可能通过减少大鼠海马组织胆碱能突触释放乙酰胆碱，从而影响大鼠学习记忆功能。

4 结论

综上所述亚慢性砷暴露可致大鼠海马组织BDNF mRNA及其蛋白的表达下调，而海马组织BDNF表达的下降可能是砷致学习记忆能力受损的机制之一。