国际癌症研究协会明确将砷及其化合物划分为人类确定的致癌物。砷摄入机体后可分布全身各处，造成肝脏^[1]、肺脏^[2]、肾脏^[3]、睾丸^[4]等多个脏器受累。无机砷(As)在体内的生物转化中因其代谢产物毒性不同从而造成肝脏毒性不同^[5]。研究表明砷甲基化过程的中间产物三价一甲基胂(mono-methyl arsine MMA^Ⅲ)毒性极强，远远超过了其他砷代谢产物^[6]。砷甲基化过程在砷毒性作用机制的研究受到广泛关注。氧化应激学说是较普遍认同的砷毒性作用的重要机制之一。砷具有明确的肝脏毒性，但关于小鼠砷甲基化水平与肝脏氧化应激关系的研究未见报道。本研究以昆明种小鼠为对象，给予三氧化二砷(As₂O₃)灌胃染毒，分析小鼠肝脏组织中砷甲基化水平与肝脏氧化应激间的关系，为砷中毒防控提供参考。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

三氧化二砷(As₂O₃)(北京化工厂生产, 分析纯，批号：890314)，按参考文献7、8方法配置As₂O₃溶液，4、2和1 mg/kg组的As₂O₃溶液分别配置成0.2、0.1和0.05 mg/mL As₂O₃溶液用于3组小鼠灌胃。KBH₄、HCl(国药集团化学试剂有限公司，分析纯，批号：20140429，20140324)；丙二醛试剂盒(malondialdehyde，MDA，A003-1)，超氧化物歧化酶试剂盒(superoxide dismutase，SOD，A001-3)，谷胱甘肽试剂盒(glutathione，GSH，A006-2)，总抗氧化能力试剂盒(total antioxidant capacity，T-AOC，A015)，蛋白标准测定试剂盒(A045-2)，均购自南京建成生物工程研究所。

原子荧光与形态分析仪(北京吉天仪器设备有限公司，SA-20，其中阴离子交换柱Hamilton PRP-X100，250 mm × 4.1 mm i.d，10 μm)；氢化物发生，参数：还原剂1.5% KBH₄，载流7% HCl；原子荧光参数：As元素灯(100 mA/45 mA)，负高压285 V，灯电流100 mA，载气400 mL/min，屏蔽气600 mL/min)；电子精密天平(上海精密科学仪器有限公司)，高速冷冻离心机(上海安亭化学仪器厂)；恒温水浴箱(上海跃进医疗仪器厂)；漩涡振荡仪(上海亚荣分析仪器公司)，酶标仪(美国Bio-Rad公司)；手动玻璃匀浆器(上海生物工程公司)；真空冷冻干燥机(ZD-A3J，南京载智自动化设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 建立动物模型

健康昆明种小鼠40只(新疆医科大学实验动物中心，动物许可证号：XK(新)2011-0004)，雌雄各半，体重(20±2) g。本实验经石河子大学医学院第一附属医院伦理委员会审查通过并实施。实验期间，动物房定期消毒，笼具定时冲洗、消毒(紫外灯，消毒液)，每天更换垫料；温度约(20~24)℃，相对湿度约45%~55%，氨浓度≤5 mg/mL，噪音≤60 dB，换气2次/d，30 min/次。按对照组、As₂O₃1、2及4 mg/kg进行灌胃染毒，小鼠按体重分层随机分至以上4组。对照组灌胃0.9%生理盐水；As₂O₃组给予1、2及4 mg/kg剂量, 按照0.2 mL/10g体重灌胃容量进行灌胃(王茜等^[9]研究发现给予小鼠1 mg/kg时可致小鼠肝组织氧化损伤，因此本次研究选取1、2和4 mg/kg As₂O₃灌胃)，连续染毒5周，各组自由饮水、摄食。

1.2.2 配制肝脏组织匀浆

染毒及干预结束次日，颈椎脱臼法处死小鼠。即刻摘取肝脏，用预冷的生理盐水漂洗去除血渍，滤纸吸干后用电子天平称重。剪取0.400 g肝脏组织，放至玻璃匀浆管口用眼科剪剪碎，按重量体积比1：9加入0.9%生理盐水，充分研碎至组织匀浆中无纤维状物质，制成10%(m/v)的肝组织匀浆，低温冷冻离心机2 500 r/min离心10 min，取上清液-20℃保存，使用时室温融化。

1.2.3 肝脏组织氧化应激指标检测

分别用相应试剂盒测定肝脏MDA含量、SOD活力、GSH含量、T-AOC水平、蛋白含量，严格按说明书方法进行。硫代巴比妥酸法测定MDA含量，WST-1法测定SOD活力，微量酶标法测定GSH含量，比色法测定T-AOC水平，考马斯亮蓝法测定蛋白含量。

1.2.4 肝脏组织测量砷甲基化产物方法

小鼠肝脏组织称重后取0.1 g，立即放置在-20℃冰箱2 h，然后将肝脏组织放入锡箔纸上剪碎放入低温干燥器干燥24 h，将干燥样品装入干燥过的2 mL冷冻管中待测。取肝脏干燥样品于5 mL聚丙烯离心管中，加入0.15 mol/L HNO₃溶液2 mL，密闭，置于90℃恒温箱中热浸提2.5 h，振摇1 min/0.5 h，提取完毕后，冷却至室温。8 000 r/min离心15 min。取0.5 mL上清液置于离心管中，加入正己烷0.5 mL，振摇1 min，8 000 r/min离心15 min，弃去上层液体。按此过程重复1次。吸取下层清液，经0.2 μm有机滤膜过滤后进SA-20进行分析。

1.2.5 总砷、各形态砷及砷甲基化模式指标计算

肝脏组织预处理后，按SA-20操作方法进行砷形态分析，检测样品中三价无机砷(As³⁺)、二甲基胂(DMA)、一甲基胂(MMA)和五价无机砷(As⁵⁺)砷代谢产物水平。每组肝脏样品分别做20、40、60 μg /L的DMA加标回收率分析，加标回收率在95%~101%范围。砷甲基化指标计算如下：总砷(TAs)=As³⁺+MMA +DMA+ As⁵⁺，无机砷百分比(As%)=(As³⁺+As⁵⁺)/TAs×100%；一甲基砷百分比(MMA%)=MMA/TAs×100%；二甲基砷百分比(DMA%)=DMA/TAs×100%；砷一甲基化指数primary methylated index，PMI)=(DMA+MMA)/TAs；二甲基化指数(secondary methylated index，SMI)=DMA/(DMA+MMA)。

1.3 统计分析

检测结果输入Excel 2003表格，应用SPSS 17.0软件进行数据分析。各组实验数据均以x+s进行统计描述，组间比较采用方差分析，多重比较采用Bonferroni法。PMI、SMI与MDA、GSH、SOD、T-AOC之间的相关性采用Spearman秩相关进行分析，检验水准α=0.05。

2 结果 2.1 实验动物的一般情况、体重及肝脏脏器系数变化

实验初期，各组动物除略有激惹和烦躁现象外，未发现其他异常情况。几天后，实验动物逐渐耐受。在染毒及干预过程中，各组动物体重从第三周开始4 mg/kg组进食量略少，体重增加较少，五周末各实验组动物体重差异有统计学意义(P＜0.05)，肝脏系数差异有统计学意义(P＜0.05；表 1)。

2.2 小鼠肝脏中总砷和砷代谢产物含量

给予小鼠不同剂量As₂O₃染毒后，小鼠肝脏组织中各形态砷含量高于对照组(P＜0.001)。随着As₂O₃的剂量增加，各形态砷代谢产物增加(P＜0.001)，但是在各类产物中DMA的含量均为最多(表 2)。

2.3 小鼠肝脏中砷甲基化水平

小鼠肝脏组织中砷甲基化水平(As%、MMA%)随着砷染毒剂量增加也显著增加(P＜0.001)；而DMA%与对照组间差异有统计学意义，但在不同砷剂量组间表现为高于1 mg/kg剂量组水平(P＜0.001)。4 mg/kg剂量组PMI、SMI均高于1 mg/kg组(P＜0.001；表 3)。

2.4 不同染砷剂量对肝脏氧化应激的影响

不同剂量As₂O₃染毒小鼠MDA含量高于对照组(P＜0.001)，而GSH、SOD、T-AOC水平显著低于对照组(P＜0.001)。高剂量组(4 mg/kg)氧化损伤程度显著高于低剂量组(1 mg/kg)，而抗氧化能力(GSH、SOD、T-AOC)显著低于低剂量组(1 mg/kg；P＜0.001)。随着As₂O₃染毒剂量的增加，小鼠肝脏氧化损伤程度加重，抗氧化能力降低(表 4)。

2.5 砷甲基化水平与肝功能损伤相关性

按照不同染毒剂量分层利用Spearman秩相关分析砷染毒小鼠肝脏氧化损伤(MDA)、抗氧化损伤(GSH、SOD、T-AOC)与砷甲基化水平(PMI、SMI)之间的关系，结果可见，在1 mg/kg染毒剂量时，PMI与T-AOC呈负相关(P＜0.005)，SMI与GSH、SOD呈负相关(P＜0.005)；在2 mg/kg染毒剂量时，PMI、SMI与MDA呈正相关(P＜0.005) 而与GSH、SOD呈负相关(P＜0.005)；在4 mg/kg染毒剂量时，PMI与MDA呈正相关(P＜0.005)，PMI、SMI与GSH、SOD呈负相关(P＜0.005；表 5)。

3 讨论

人可以通过呼吸道、消化道或皮肤途径摄入砷及其化合物，开展砷中毒相关研究有着重要的公共卫生意义。研究表明，元素的生理功能及其生物毒性作用与其在生物体内存在的物化形态有着密切的关系^[10]。砷的代谢产物MMA^Ⅲ的毒性远远高于三价无机砷，而二甲基胂(DMA)与砷致癌有着密切的关系^[11]。开展砷甲基化代谢水平与砷的毒性作用对于揭示砷甲基化代谢在砷毒性中的作用意义重大。

肝组织中各种形态砷含量显著增加且以DMA为主，说明三价无机砷进入小鼠机体后通过血液分布蓄积在肝脏组织中，并完成了甲基化过程。另外，随着剂量的增加砷甲基化的代谢产物MMA、DMA含量及其百分比、PMI、SMI也显著增加；PMI和SMI分别反应了砷进入机体后进行第一次甲基化的能力和将MMA进一步甲基化为DMA的能力。本结果说明随着As₂O₃的剂量增加，肝脏中砷甲基化的水平显著增强。结果与吴军等^[12]报道的结果相似。

氧化应激是砷中毒的重要机制之一。本研究表明，砷染毒组小鼠肝脏氧化损伤程度越严重，抗氧化能力下降，说明砷染毒导致小鼠肝脏自由基增加，引起了过氧化反应，肝脏组织抗氧化能力降低。另外，DMA还可与GSH反应生成二甲基胂—谷胱甘肽螯合物，进一步被还原为二甲基胂酸，再与O₂反应形成二甲基胂自由基和二甲基胂过氧化物，从而导致肝脏氧化应激反应。

在不同砷染毒剂量时，PMI、SMI与MDA活性呈正相关关系，与GSH、SOD呈负相关关系。这一结果提示砷在肝脏中的甲基化能力不同导致的肝脏氧化应激程度不同，甲基化水平越高可能导致的肝脏氧化损伤越重，抗氧化能力越低。可能是因为砷在肝脏中蓄积的主要甲基化代谢产物为DMA，而DMA增多可以导致机体产生大量的O₂^-、H₂O₂、·OH以及甲基化胂等多种活性氧(ROS)自由基^[13]，进而引发肝脏组织氧化损伤。

综上所述，随着砷染毒剂量的增加，小鼠肝脏组织中蓄积的各种形态砷含量明显增加，砷甲基化水平显著增强，导致小鼠肝脏氧化应激严重。氧化损伤是砷毒性作用的重要机制之一，今后应拓宽小鼠砷染毒剂量范围，观察更大染毒剂量范围肝脏中砷甲基化水平的变化规律，探讨砷甲基化水平与肝脏氧化损伤的分子机制，为揭示砷甲基化与肝损伤机制提供参考。本研究也存在如下局限性：根据文献方法研究仅是基于现有方法开展的染毒实验，尚未就染毒物质进行鉴定存在缺陷；对照组仅为生理盐水，未设置溶剂对照存在对组不足的问题。