纳米二氧化硅(nm-SiO2)因具有稳定性、融变性和易散性等特殊的性质已经被广泛应用于疾病生物标记、药物运输、DNA运输载体、肿瘤活体成像等诸多方面[1-2]。众所周知，微米二氧化硅(μm-SiO2)是一种高毒性的颗粒物，能够引起肺纤维化，已被国际癌症研究中心确认为确定人类致癌物[3]。一些研究资料指出，微米级颗粒材料当粒径达到纳米级时，可进入机体并穿过体内的生物屏障系统到达微米颗粒物所不能到达的区域，如循环系统、生殖系统、甚至细胞内，在一定条件下可以转移到细胞核内，一些原本无毒或低毒的微米级颗粒材料当粒径达到纳米级时，毒性可显著增强[4-6]。因此，有学者提出越小的纳米颗粒越有可能穿透细胞并产生毒性作用，但也有学者指出这种说法是片面的，并不是所有的纳米颗粒都能进入细胞，决定纳米物质的生物效应的因素非常多[7]。关于nm-SiO2对人体产生的生物效应及其作用机制目仍不十分明确。
A549细胞为人肺腺癌上皮细胞，在体外培养呈现典型的Ⅱ型肺泡上皮细胞，在刺激因素的作用下，可以合成并分泌细胞炎性因子，如白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子(TNF-α)等，介导炎性反应[8]。因此A549细胞是评价外来物质诱导炎症反应能力的理想模型。本研究将3种粒径纳米(20、60和100 nm) SiO2和微米(0.1~5 μm)SiO2以不同的剂量对A549细胞进行染毒，观察其对A549细胞毒性效应及炎性因子分泌的影响，并探讨其在细胞损伤中的作用机制。
1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 1.1.1 仪器全自动酶标仪(Bio-Rad Bio-Rad550，美国)，CO2培养箱(Forma 3110，美国)，低速台式离心机(TDZ4—WS，白洋离心机厂)，倒置显微镜(U-LH100HG，日本)。蒸气高压灭菌器(1630MK，以色列)。
1.1.2 试剂A549细胞(北京协和医院中心实验室赠)，RPMI-1640培养基和胎牛血清(GIBCORL，美国)，四甲基偶氮唑盐(Pittsburgh, PA, 美国)，乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，白细胞介素8(IL-8) 和肿瘤坏死因子(TNF-α)测定试剂盒(Boechinger Mannheim，德国)，纳米SiO2(20、60和100 nm，纯度≥99.5%，深圳市德方纳米科技有限公司)，微米SiO2(粒径为0.1~5 μm，85%，Sigma公司)。
1.2 方法 1.2.1 颗粒物混悬液配制将纳米二氧化硅和微米二氧化硅置于蒸气压力灭菌器中灭菌30 min，用加入不含血清的RPMI-1640培养基配制成质量浓度为200、100、50、25、12.5和0 μg/mL的SiO2混悬培养液，待细胞染毒。
1.2.2 细胞复苏及传代培养取冻存细胞，在37℃水浴箱中迅速解冻，移至离心管，加入新RPMI-1640培养液，1 000 r/min离心3 min，弃上清，沉淀混匀加入含10%胎牛血清(FBS)的培养液放入培养箱中培养，每日换液1次。待细胞生长致覆盖培养皿表面约80%时，弃去原培养液，磷酸缓冲液(PBS)冲洗2遍，加入适量0.25%胰蛋白酶消化细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入少量培养液吹打至单细胞悬液，以1:2~3比例传代培养。每2~3 d传代1次。
1.2.3 细胞存活率检测取对数生长期的A549细胞，调整细胞浓度为5×106个/mL接种于96孔细胞培养板，每孔200 μL，置于37℃、5%CO2培养箱恒湿条件下培养24 h，弃去培养液，加入不含血清的、SiO2终浓度为200、100、50和0 μg/mL的混悬培养液对细胞进行染毒，培养24 h后，加入10 μL MTT试剂继续培养4 h，小心弃去培养上清液，加入200 μL二甲基亚砜(DMSO)，震荡10 min，在490 nm波长处测定OD值，每个浓度设5个平行孔，计算细胞的相对存活率(处理组吸光值占对照组吸光值的百分率)。
1.2.4 LDH的测定取对数生长期的A549细胞，调整细胞浓度为5×106个/mL接种于6孔细胞培养板，37 ℃、5%CO2恒湿条件下培养24 h，弃去培养液，加入不含血清的、终浓度为200、100、50和0 μg/mL的SiO2混悬培养液对细胞进行染毒，每个浓度设5个平行孔，培养24 h后，收集细胞培养液，1 000 r/min离心10 min，取上清液测LDH活性，操作按试剂盒说明进行。
1.2.5 细胞炎性因子的测定实验操作方法同上，细胞培养液上清液测定白细胞介素8(IL-8) 和肿瘤坏死因子(TNF-α)含量，实验操作按试剂盒说明进行。
1.3 统计分析实验数据以x±S表示，应用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，采用单因素方差分析(One way ANOVA)，各组与对照组比较采用Dunnet-t检验，各组间两两比较采用Q检验，P＜0.05时认为差异有显著性。
2 结果 2.1 不同粒径纳米和微米SiO2对A549细胞的细胞存活率影响由表 1可知，μm-SiO2作用A549细胞24 h后仅在最高剂量时，细胞存活率显著低于对照组(P＜0.05)，60-nm-SiO2、100-nm-SiO2组在较低剂量(≤ 50μg/mL)时细胞存活率未发生明显改变，但当剂量达到100和200 μg/mL时，细胞存活率明显低于对照组(P＜0.01)。20-nm-SiO2组对细胞存活率的影响最大，在较低剂量25 μg/mL时可使细胞存活率显著降低(P＜0.05)，且20-nm-SiO2对细胞存活率的影响成剂量依赖趋势，即随剂量的增大细胞存活率逐渐降低。
| 组别 | 样本数(个) | 染毒浓度(μg/mL) | |||||
| 0 | 12.5 | 25 | 50 | 100 | 200 | ||
| 对照组 | 5 | 100.0±6.71 | - | - | - | - | - |
| μm-SiO 2组 | 5 | - | 101.71±9.40 | 97.24±10.69 | 97.44±8.49 | 88.43±8.11 | 82.19±76.31* |
| 100-nm-SiO2组 | 5 | - | 103.54±13.33 | 95.28±7.39 | 91.26±8.36 | 79.01±5.44** | 64.6±5.16**a |
| 60-nm-SiO2组 | 5 | - | 96.25±11.28 | 93.50±10.81 | 85.39±7.92 | 68.45±4.83**aa | 50.70±4.82**aabb |
| 20-nm-SiO2组 | 5 | - | 89.11±7.30 | 80.37±6.77*a | 57.83±6.15**aabbcc | 50.72±3.87**aabbc | 32.48±4.05**aabbc |
| 注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与相同浓度的微米组比较，aP＜0.05，aaP＜0.01；与相同浓度的100 nm组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01；与相同浓度的60nm组比较，cP＜0.05，ccP＜0.01 | |||||||
2.2 不同粒径纳米和微米SiO2对A549细胞LDH活性的影响
由表 2可知，μm-SiO2作用A549细胞24h后，各剂量组细胞培养液中的LDH活力与对照组相比略有升高，但均无显著性差(P＜0.05)。20-nm-SiO2、60-nm-SiO2、100-nm-SiO2作用细胞后，细胞培养液中LDH活力均升高, 60-nm-SiO2组、100-nm-SiO2组当剂量达到100μg/mL、200μg/mL时，LDH活力显著高于对照组(P＜0.01)，而20-nm-SiO2组在剂量为50 μg/mL时，LDH活力显著高于对照组(P＜0.01)，且随着剂量的增大LDH活力增高，呈现剂量依赖趋势。在相同染毒浓度条件下，20-nm-SiO2组LDH活力显著高于60-nm-SiO2组(P＜0.05)、60-nm-SiO2组LDH活力显著高于100-nm-SiO2组(P＜0.05或P＜0.01)。
| 组别 | 样本数(个) | 染毒浓度(μg/mL) | |||
| 0 | 50 | 100 | 200 | ||
| 对照组 | 5 | 38.73±6.18 | - | - | - |
| μm组 | 5 | - | 40.81±5.22 | 48.10±9.10 | 47.06±12.53 |
| 100-nm-SiO2组 | 5 | - | 43.72±7.31 | 107.84±10.63**aa | 137.17±16.47**aa |
| 60-nm-SiO2组 | 5 | - | 51.43±8.11 | 141.20±10.71**aab | 198.64±12.75**aabb |
| 20-nm-SiO2组 | 5 | - | 170.90±8.54**aabbcc | 206.11±7.17**aabbcc | 263.77±11.80**aabbc |
| 注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与相同浓度的微米组比较，aP＜0.05，aaP＜0.01；与相同浓度的100 nm组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01；与相同浓度的60nm组比较，cP＜0.05，ccP＜0.01 | |||||
2.3 不同粒径纳米和微米SiO2对A549细胞IL-8分泌的影响
由表 3可知，与对照组相比，μm-SiO2作用A549细胞24 h后，未引起细胞分泌IL-8的显著变化(P﹥0.05)。在染毒浓度为50和100μg/mL时，20-nm-SiO2、60-nm-SiO2、100-nm-SiO2作用细胞后引起IL-8的分泌量均显著高于对照组(P＜0.05或P＜0.01)，但随染毒浓度增高，IL-8的分泌量呈现下降趋势。在染毒浓度为50 μg/mL时，20-nm-SiO2组IL-8的分泌量均显著高于100-nm-SiO2组(P＜0.01)。
| 组别 | 样本数(个) | 染毒浓度(ng/mL) | |||
| 0 | 50 | 100 | 200 | ||
| 对照组 | 5 | 0.17±0.01 | - | - | - |
| μm组 | 5 | - | 0.17±0.01 | 0.18±0.02 | 0.20±0.01 |
| 100-nm-SiO2组 | 5 | - | 0.22±0.01* | 0.22±0.01* | 0.20±0.01 |
| 60-nm-SiO2组 | 5 | - | 0.24±0.02**a | 0.23±0.02* a | 0.19±0.02 |
| 20-nm-SiO2组 | 5 | - | 0.31±0.02**aabbc | 0.25±0.02**a a | 0.18±0.02 |
| 注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与相同浓度的微米组比较，aP＜0.05，aaP＜0.01；与相同浓度的100 nm组比较bP＜0.05，bbP＜0.01；与相同浓度的60nm组比较，cP＜0.05，ccP＜0.01 | |||||
2.4 不同粒径纳米和微米SiO2对A549细胞TNF-α分泌的影响
由表 4可知，与对照组相比，μm-SiO2作用A549细胞24 h后，μm-SiO2未引起细胞分泌TNF-α的显著变化(P＞0.05)。在染毒浓度为50 μg/mL时，60-nm-SiO2、100-nm-SiO2作用细胞后引起细胞分泌TNF-α的量增加，但与对照组相比差异无显著性(P＞0.05)。其他剂量组与对照组相比未引起细胞分泌TNF-α的量增加(P＞0.05)。
| 组别 | 样本数(个) | 染毒浓度(ng /mL) | |||
| 0 | 50 | 100 | 200 | ||
| 对照组 | 5 | 0.25±0.02 | - | - | - |
| μm组 | 5 | - | 0.24±0.02 | 0.25±0.01 | 0.24±0.02 |
| 100-nm-SiO2组 | 5 | - | 0.28±0.03 | 0.25±0.02 | 0.25±0.04 |
| 60-nm-SiO2组 | 5 | - | 0.28±0.02 | 0.24±0.02 | 0.26±0.02 |
| 20-nm-SiO2组 | 5 | - | 0.29±0.02 | 0.27±0.01 | 0.24±0.01 |
| 注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与相同浓度的微米组比较，aP＜0.05，aaP＜0.01；与相同浓度的100 nm组比较bP＜0.05 bbP＜0.01；与相同浓度的60 nm组比较，cP＜0.05，ccP＜0.01 | |||||
3 讨论
本研究结果表明，染毒24 h后，3种粒径nm-SiO2均可引起A549细胞的细胞存活率降低，但60-nm-SiO2、100-nm-SiO2在较高剂量(100、200 μg/mL)时，细胞存活率明显降低，而20-nm-SiO2在较低剂量25μg/mL时可使细胞存活率显著降低(P＜0.05)，且在相同浓度条件下，20-nm-SiO2对细胞存活率的影响最大；μm-SiO2仅在最高剂量时引起细胞存活率明显降低。说明nm-SiO2粒径越小，其细胞毒性愈大，而μm-SiO2对A549细胞的毒性细胞明显低于nm-SiO2。
乳酸脱氢酶(LDH)是活细胞的胞浆酶之一，正常情况下LDH不能透过细胞膜而渗漏到细胞培养液中，但当细胞膜受损时则可释放到细胞外，此时培养液中LDH的活力与细胞膜的损伤程度成正比。因此，通过检测细胞培养液中LDH的活力，则可判断细胞膜受损的程度。本研究结果显示，μm-SiO2未引起细胞培养液中LDH活力改变，3种粒径nm-SiO2均可引起细胞培养液中LDH活力升高，但在相同染毒浓度条件下，随着3种nm-SiO2粒径的逐渐减小，细胞培养液中LDH活力逐渐增高，且高浓度暴露下培养液中LDH含量更高，说明nm-SiO2粒径越小，对细胞膜的受损越严重，且高浓度的暴露更能引起细胞膜的损伤，造成细胞的死亡，LDH释放量与细胞死亡率之间存在一致关系。
Park等[9]研究显示，纳米二氧化硅可被吸收至多种细胞的细胞核中，而微米级SiO2只能到达细胞间质，而不能进入细胞质内。赵光强等[10]采用透射电子显微镜观察不同粒径二氧化硅细胞内分布，微米级二氧化硅组细胞质内未发现高电子密度颗粒及吞饮泡，膜结构完整。纳米二氧化硅组细胞间质可见高电子密度纳米二氧化硅颗粒，部分膜不完整。本研究结果与上述研究一致，纳米级SiO2能够破坏细胞膜，使LDH可释放到细胞外，造成细胞死亡，这可能是纳米级SiO2引起细胞损伤的作用机制之一。而微米级SiO2不能破坏细胞膜的完整性，不能进入细胞质内，从而未能引起明显的细胞毒性效应。
IL-8和TNF-α在炎症过程中发挥多种功能[11-12]，是评价外源有害因素诱导炎症反应能力的理想指标。本研究发现，μm-SiO2未引起细胞分泌IL-8和TNF-α的变化，而3种粒径nm-SiO2均可使细胞分泌IL-8的量增加，在相同染毒浓度条件下，3种粒径nm-SiO2随着粒径的逐渐减小，刺激细胞分泌IL-8的量增高，这与Donaldson等[13]的研究一致，当颗粒物的粒径小于100 nm时，随着粒径的减小，粒子的表面积显著增加，单位质量的纳米粒子具有更强的生物活性，表现在能够刺激细胞炎性反应，从而产生更大的破坏作用。本研究还发现，随着染毒浓度的增加，3种粒径nm-SiO2使细胞分泌IL-8的量呈下降趋势。这可能是由于随着染毒浓度的增加，细胞的死亡数量增加，能分泌IL-8的细胞数量减少所导致。本研究结果显示，3种粒径nm-SiO2均未引起细胞分泌TNF-α的明显变化。TNF-α除具有炎性介质作用外，也是多种细胞因子(如IL-6、IL-8等)的启动因子[14]。染毒时间至24 h，TNF-α可能在此时间点发挥作用已完成而恢复正常，而后诱发的IL-8分泌发挥其炎性的作用，因此染毒24 h后，细胞分泌IL-8增加，而TNF-A水平未见明显异常。建议今后可以选取不同染毒时间对纳米颗粒物的炎性作用机制进行进一步探讨。
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