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砷及其化合物广泛分布于自然界中，可通过饮用水、燃煤、冶炼、农药、药品或饲料添加剂等途径进入人类的生活环境[1]。目前研究认为，氧化应激是砷中毒的重要机制之一[2], 而可溶性无机砷几乎100%可被人的胃肠道吸收，因而对人体产生较大的损伤[3]。原花青(procyanidins，PC)是目前发现强效的抗氧化剂，是广泛存在于植物界的天然多酚化合物, 属于双黄酮衍生物，具有较强的清除自由基和抗氧化活性，可以对机体起到保护作用[4]。葡萄籽提取物原花青素(grape seed procyanidin extract，GSPE)中PC的含量最高可达95%[5]，其基本单体儿茶素和表儿茶素形成的二聚体分布广泛，抗氧化活性最强[6]。关于GSPE对三氧化二砷(As2O3)所致肝脏损伤的拮抗作用尚未见报道，本研究在As2O3染毒小鼠的基础上给予不同剂量GSPE干预，探讨不同剂量GSPE对As2O3所致的肝脏损伤拮抗作用效果的差异。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器As2O3，北京化工厂生产(分析纯，批号890314)，按4.0 mg/(kg·bw)染毒剂量配置溶液，灌胃体积为20 mL/(kg·bw)，故灌胃浓度0.2 mg/mL。葡萄籽提取物(内含原花青素纯度＞95.0%)，天津尖峰天然产物研究开发有限公司生产。按100、200和400 mg/(kg·bw)剂量配置PC溶液，低、中、高剂量组溶液质量浓度分别为10、20和40 mg/mL，灌胃体积为10 mL/(kg·bw)。AST试剂盒(C010-1)，ALT试剂盒(C009-1)，MDA试剂盒(A003-1)，SOD试剂盒(A001-3)，GSH试剂盒(A006-2)，T-AOC试剂盒(A015)，蛋白标准测定试剂盒(A045-2)，均购自南京建成生物工程研究所。电子精密天平(上海精密科学仪器有限公司)，高速冷冻离心机(上海安亭化学仪器厂)，恒温水浴箱(上海跃进医疗仪器厂)，漩涡振荡仪(上海亚荣分析仪器公司)，酶标仪(美国Bio-Rad公司)，手动玻璃匀浆器(上海生物工程公司)。
1.2 动物及处理方法SPF级健康雄性昆明种小鼠50只，体重(20±2) g (购自新疆医科大学动物实验中心，动物许可证号：XK(新)2011-0004)；动物饲养条件为温度约22℃，相对湿度约50%，氨质量浓度≤ 5 mg/mL，噪音≤ 60 db，换气2次/d，30 min/次，笼具定时冲洗、消毒。处理过程中小鼠均自由摄食、饮水。适应性饲养1周后，按体重随机分成5组，分别为空白对照组(生理盐水组)、As2O3组(4 mg/kg·bw)、As2O3(4.0 mg/kg·bw)+GSPE低(100 mg/kg·bw)、中(200 mg/kg·bw)、高(400 mg/kg·bw)剂量组，每组10只，各组连续灌胃给药5周，空白对照组给予相同剂量0.9%NS，各组均自由摄食、饮水；观察小鼠体重(每天称重1次)、饮食和饮水、活动情况及一般中毒表现。饲养5周后处死，采集肝组织。
1.3 检测指标及方法 1.3.1 肝脏脏器系数计算用颈椎脱臼法处死实验小鼠，摘取肝脏，用预冷的生理盐水漂洗，去除血渍，滤纸吸干后，电子天平称重，并计算肝脏(脏器)系数。
1.3.2 肝匀浆制备剪取0.400 g肝脏组织，将其放入玻璃匀浆管口用眼科剪剪碎，按照重量体积比1：9加入生理盐水，充分研碎，使组织匀浆化，看不到纤维状物质为止。制成10%(m/v)的肝脏组织匀浆，低温冷冻离心机2 500 r/min离心10 min，取上清液-20℃保存，使用时室温融化。
1.3.3 GSH、MDA含量，ALT、AST、SOD活力，T-AOC水平及蛋白标准测定GSH采用微量酶标法，MDA采用硫代巴比妥酸法，ALT、AST采用赖氏法，SOD采用WST-1法，T-AOC采用化学比色法，蛋白标准测定采用考马斯亮蓝法测定。
1.4 统计处理检测结果输入Excel 2007表格，应用SPSS 17.0软件进行数据分析。各组实验数据均以x±s进行统计描述，不同剂量原花青素干预组的肝脏毒性采用完全随机设计多组比较方差分析(SNK-q检验)，检验水准α=0.05，P＜0.05认为有统计学差异。
2 结果 2.1 不同剂量GSPE干预对小鼠体重、肝重及肝脏系数的影响As2O3+GSPE各剂量组小鼠肝重、肝脏系数均低于As2O3组，差异有统计学意义(P＜0.05；表 1)。
| 组别 | 体重(g) | 肝重(g) | 肝脏系数(%) |
| 对照组 | 35. 73±3. 44a b c d | 1.32±0.18b c d | 4.10±0.49 |
| As2O3 | 26.44±1.87 | 3.26±0.15b c d e | 8.58±0.67b c d e |
| As2O3+GSPE低剂量组 | 28.38±1.99 | 1.02±0.14 | 3.58±0.36 |
| As2O3+GSPE中剂量组 | 31.43±1.08a b | 1.16±0.14b d | 3.70±0.43 |
| As2O3+GSPE高剂量组 | 28.61±1.89 a b | 1.13±0.20b | 3.96±0.23 |
| F | 18.171 | 333.9374 | 215.1306 |
| P | ＜0.001 | ＜0.001 | ＜0.001 |
| 注:a与As2O3组比较，P＜0.05；b与GSPE低剂量组组比较，P＜0.05；c与GSPE中剂量组组比较，P＜0.05；d与GSPE高剂量组组比较，P＜0.05；e与对照组比较，P＜0.05 | |||
As2O3+GSPE中、高剂量组体重均高于As2O3组差异有统计学意义(P＜0.05)。As2O3+GSPE低剂量组小鼠体重低于As2O3+GSPE中剂量组，As2O3+GSPE低剂量组小鼠肝重低于As2O3+GSPE中、高剂量组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.2 不同剂量GSPE干预对小鼠肝组织中AST、ALT活力的影响As2O3组肝脏中AST(32.35±7.44) U/(g prot)高于对照组(18.92±8.91) U/(g prot)，ALT(131.52± 65.60))U/(g prot)高于对照组(69.29±31.06) U/(g prot)(P＜0.05)。As2O3+GSPE中、高剂量组AST活力均低于As2O3组，并且呈剂量依赖，差异具有统计学意义(P＜0.05)；As2O3+GSPE高剂量组ALT活力低于As2O3组(P＜0.05；表 2)。
| 组别 | AST (U/g prot) | ALT (U/g prot) |
| 对照组 | 18.92±8.91 | 69.29±31.06 |
| As2O3组 | 32.35±7.44c d e | 131.52±65.60d e |
| As2O3+低GSPE组 | 31.24±19.06c d e | 94.26±65.34 |
| As2O3+中GSPE组 | 12.08±7.53 | 88.89±35.27 |
| As2O3+高GSPE组 | 11.30±5.16 | 68.43±31.27 |
| F | 8.8480 | 2.8024 |
| P | ＜0.001 | 0.0368 |
| 注:c与GSPE中剂量组组比较，P＜0.05；d与GSPE高剂量组组比较，P＜0.05;e与对照组比较，P＜0.05 | ||
2.3 不同剂量GSPE干预对小鼠肝组织中氧化指标(MDA含量)和抗氧化指标(GSH含量、SOD活力、T-AOC水平)的影响
As2O3+GSPE低、中、高剂量组MDA含量均低于As2O3组(P＜0.05)；As2O3+GSPE低、中、高剂量组GSH含量、T-AOC水平依次升高，且均高于As2O3组(P＜0.05；表 3)。
| 组别 | MDA (nmol/mg prot) |
GSH (μmol/g prot) |
SOD (U/g prot) |
T-AOC (U/mg prot) |
| 对照组 | 31.15±15.26 | 344.08±56.43 a b c d | 21.09±7.69 | 10.79±1.52 a b c |
| As2O3组 | 171.17±21.50b c d e | 48.65±14.69 | 25.80±4.65 | 2.52±0.85 |
| As2O3+ GSPE低剂量组 | 37.24±13.26 | 137.17±34.70a | 25.56±13.02 | 5.33±0.76a |
| As2O3+ GSPE中剂量组 | 31.42±27.17 | 198.02±41.28 a b | 32.43±22.48 | 7.07±0.83a b |
| As2O3+ GSPE高剂量组 | 33.99±19.81 | 272.06±35.85a b c | 28.56±20.36 | 11.54±1.86a b c |
| F | 94.9089 | 86.9331 | 0.7464 | 91.5508 |
| P | ＜0.001 | ＜0.001 | 0.5656 | ＜0.001 |
| 注：a与As2O3组比较，P＜0.05；b与GSPE低剂量组组比较，P＜0.05；c与GSPE中剂量组组比较，P＜0.05；d与GSPE高剂量组组比较，P＜0.05；e与对照组比较，P＜0.05 | ||||
3 讨论
由于砷在地球中的分布特点，以及受各地区的生态环境和气候影响，地球岩石中砷化合物以砷酸盐及亚砷酸盐等形式大量溶入地下水中，导致地域性水砷含量增加[7]。在我国，地方性砷中毒分布范围广，受影响人口众多，开展拮抗砷毒性作用的研究具有重要意义[8]。人长期暴露于过量的砷，可引起急慢性砷中毒[9]。砷具有肝脏毒性，主要损伤机制是砷代谢、转化过程中产生大量活性氧，当机体无法清除时就会发生脂质过氧化，并产生脂质过氧化物，进而导致肝脏氧化损伤[10]。牛楠楠等[11]用3 mg/kg亚砷酸钠水溶液对SD大鼠进行自由饮水染毒，染毒后检测ALT, AST作为肝功能分析指标，结果发现，砷染毒组AST，ALT水平均高于空白对照组。本次研究发现对昆明种雄性小鼠给予4.0 mg/kg剂量染毒后，染砷组AST、ALT高于对照组，说明砷造成肝功能损伤，可以在一定程度上反映其肝脏毒性作用。李富君等[12]在亚慢性砷中毒实验中用低(0.125 mg/kg)、中(0.5 mg/kg)、高(2.0 mg/kg)、超剂量组(8.0 mg/kg)亚砷酸钠水溶液给昆明种雄性小鼠灌胃染毒，染毒结束后对肝脏GSH、SOD、MDA进行检测，结果发现染毒组GSH、SOD均低于对照组，中、高、超剂量组MDA均高于对照组。Pari[13]等用5 mg/kg的NaAsO2对大鼠经口染毒30 d后发现肝脏中GSH含量以及SOD、GSH-Px的活性下降。本次研究发现，用4.0 mg/kg剂量染毒后，染砷组GSH、SOD低于对照组，MDA高于对照组，说明了砷具有抑制肝脏抗氧化酶及加重脂质过氧化作用，与已有研究报道[14]结果一致。
PC具有极强的抗氧化活性[15]，是一种良好的自由基清除剂和脂质过氧化抑制剂。丁玉松等[16]认为PC对As2O3所致睾丸组织的氧化损伤具有一定的拮抗作用，并且能够显著提高染毒小鼠的抗氧化损伤能力。Yun等[17]研究表明，GSPE可提高GSH水平，GSH水平增高可减轻砷诱导的氧化应激毒性作用。本次研究发现As2O3+GSPE不同剂量组GSH、SOD、T-AOC均高于染毒组，而肝重、肝脏系数、MDA均低于染毒组，表明GSPE对砷引起的小鼠肝脏氧化损伤具有拮抗作用；本次研究还发现As2O3+GSPE不同剂量组肝重、肝脏系数、GSH、T-AOC指标均随剂量增加而增高，MDA均随剂量增加而降低。以上结果说明GSPE可能通过清除自由基并在一定程度上提高小鼠肝脏抗氧化能力，以拮抗砷对雄性小鼠所致的肝脏毒性作用，且其抗氧化能力的提高随剂量增加而增加。
综上所述，通过不同剂量GSPE干预以后，小鼠的GSH、SOD、T-AOC相对于砷染毒组有所升高，且MDA相对于染毒组有所降低，可能是通过提高抗氧化酶活力和清除自由基的抗氧化损伤机制来抵抗砷所致的氧化损伤，并且高剂量干预效果较好。
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