近年来多个城市开展了空调冷却水、冷凝水、淋浴水中军团菌污染的研究，相关报道样品中军团菌阳性检出率20%~90%^[1-4]不等，但关于环境样品军团菌定量检测结果的报告较少，而环境中存在的菌量不同，对人群健康危险度也不同。本文在《公共场所集中空调通风系统卫生规范》(WS 394-2012)^[5]的基础上，提出培养法检测包括空调系统冷却水、冷凝水，景观水、自来水、淋浴水、温泉水、集中空调通风管道积尘、景观土、盆栽土等样品中军团菌定量检测方法和计算模式。通过对相关课题中实际样品的验证，认为该方法可用于上述样品中军团菌的定量检测。

1 材料与方法 1.1 菌株与样品采集

水和土壤加标实验所用菌株采用美国菌种保藏中心嗜肺军团菌Ⅰ型(编号：ATCC33152)。

空调系统冷却水、自来水、淋浴水样品采自北京市某宾馆，景观土、盆栽土、花园土样品采自北京市某社区。

1.2 试剂与仪器

军团菌培养基础粉(英国Oxoid公司)、培养添加剂(北京友康生物公司)、分型血清(日本生研株式会社、天津生物芯片)、Tween 80-PBS洗脱液(0.1 mol/LPBS加入Tween 80的最终浓度为0.01%)、0.85%浓度NaCl、0.1 mol/L硫代硫酸钠(Na₂S₂O₃)。酸处理液为0.2 mol/L HCL-KCL溶液(用KOH调节pH至2.2±0.2)。培养所用培养基、试剂均需高压灭菌后使用。

0.45 μm微孔滤膜、4500E型CO₂培养箱(美国Nuaire公司)、LabconcoA2型生物安全柜(美国Waters公司)、WSZ-100型旋转振荡器(东明医疗仪器厂)、普通电子恒温水浴锅(长风仪器仪表公司)。

1.3 环境样品采集和前处理方法

1.3.1 水样品

样品类型包括冷却水、自来水和淋浴水。水样采集按《公共场所集中空调通风系统卫生规范》(WS 394-2012)^[5]采样和检验方法进行。采样时每份水样需至少500 mL，0.45 μm微孔滤膜过滤样品后加入10 mL原水充分洗脱。

1.3.2 土壤样品

样品类型包括景观土、花园土和盆栽土。按参考文献^[6]方法采集处理。取土样时选取1 m²按5点采样方法，去除1 cm左右的土壤表层后挖取土样，混合均匀取100 g/份置于灭菌容器中。盆栽土等去除表面落叶杂物后，在花卉的周围均匀采取土样，土样量不少于20 g/份。无菌称取5 g土壤样品置于带有适量玻璃珠的灭菌三角烧瓶中，加入45 mL洗脱液，200~250 rpm振荡20 min，室温静置至上层液体澄清，此上清液为前处理样品。

1.4 样品检测与处理方法

前处理样品需分别进行热处理和酸处理。热处理：取1 mL前处理后样品，加入到带盖无菌管中，置于50±1℃水浴15~30 min(可视样品情况适当调整)。酸处理：取1 mL前处理后样品，加入酸处理液0.1~0.5 mL，调pH值至2.0~2.2，轻轻摇匀，酸处理时间5~10 min。

取不处理、热处理及酸处理样品各0.2 mL，分别划线接种GVPC平板，使培养后应形成单个菌落。将接种平板静置于5% CO₂培养箱中，温度35~37℃，孵育3~10 d。

1.5 加标实验方法

1.5.1 加标菌液制备

选用ATCC33152四代菌株，35~37℃、5% CO₂培养箱中培养72 h，取菌苔生长丰富的BCYE斜面，加入灭菌水10 mL，洗下菌苔充分混匀，进行梯度稀释，制备浓度为5×10、5×10²、5×10³、5×10⁴ cfu/mL标准菌液。

1.5.2 实验方法

取PCR检测军团菌为阴性的水样品500 mL，加入5×10¹ cfu/mL标准菌1 mL悬液，0.45 μm微孔滤膜过滤浓缩后加入10 mL原水充分洗脱，该水样品军团菌的加标量为10^-1 cfu/mL。同法制备加标量为10⁰~10² cfu/mL浓度的加标样品。

取PCR检测军团菌为阴性的土样品5 g置于灭菌乳钵中，均匀滴加5×10¹ cfu/mL菌液1 mL至充分混匀，该土壤样品军团菌的加标量10¹ cfu/g。同法制备加标量为10²~10⁴ cfu/g浓度的加标样品。加标土壤样品加入45 mL Tween 80-PBS充分混匀，制成混悬液。

余下步骤按1.3~1.4节操作。加标实验回收率计算：

1.6 鉴定

孵育72 h后，从GVPC平板上用接种环挑取可疑菌落，接种BCYE和BCYE-CYS平板。对可疑菌落进行血清学鉴定^[6]确定是否为军团菌。按《公共场所集中空调通风系统卫生规范》(WS 394-2012)^[5]生化培养与血清学实验可进一步确定是否为嗜肺军团菌。

1.7 结果计算

军团菌计数结果按照水样品“cfu/L”和土样品“cfu/g”报告。军团菌定量计算模式：

式中N：样品中军团菌菌落数，cfu/L或cfu/g；

n：平均每平板可疑军团菌菌落数，cfu/皿；

D：溶液稀释倍数。

2 结果 2.1 加标实验回收率与检出限

水样品加标实验结果见表 1。结果显示当加标量为10^-1 cfu/mL时，未检出所加标准菌；当加标量为10⁰ cfu/mL，9份样品共有3份检出，其中2份回收率为50%，1份为40%；当加标量≥10¹ cfu/mL时，9份样品均可检出标准菌。加标浓度为10¹ cfu/mL时，加标实验回收率为81%~95%。

土壤样品加标实验结果见表 2。结果显示，当加标量为10 cfu/g时，未检出所加标准菌；当加标量为10² cfu/g时，14份样品有9份检出，加标实验阳性样品1份样品的回收率80%，6份样品的回收率20%；当加标量≥10³ cfu/g时，8份样品均可检出标准菌。加标浓度为10³ cfu/g时，加标实验回收率1份为30%，1份为90%，6份样品均等于或高于40%。

2.2 样品检测结果

采用本方法对北京市某宾馆10份水样和某社区6份环境土样品进行检测，应用1.7节军团菌定量计算模式报告结果。溶液稀释倍数：水样品取10倍，土壤样品取50倍；样本量：水样品取0.5 L，土壤样品取5 g。

结果显示1份冷却水样品浓度为4 000 cfu/L；5份淋浴水浓度范围900~140 000 cfu/L；1份景观土样品浓度为2 550 cfu/g；2份盆栽土浓度范围8 000~10 800 cfu/g。水样品检出LP1、LP6、LP7、LP10和非嗜肺血清型。土壤样品检出L.feeleii和非嗜肺血清型(表 3)。

3 讨论

目前国内军团菌污染报道多为水系统污染，检测方法多基于《公共场所集中空调通风系统卫生规范》(WS 394-2012)^[5]，且以定性结果为主。除水系统外，土壤环境中也生存着大量会对人体产生危害的军团菌，目前已有的参考文献^[6]仅可得到定性结果。qPCR方法虽可得到定量结果，但无法鉴别细菌的死活，所得量值为VBNC状态菌落、死菌和活菌的总数量^[8]，并且检测成本高于培养法。本文以微生物检验金标准培养法为基础，在《公共场所集中空调通风系统卫生规范》(WS 394-2012)^[5]和《水质军团藻属的检测和计数第2部分:对含低量细菌的水进行直接膜过滤的方法》(ISO 11731-2-2004)^[7]基础上，通过阴性样本加标实验提出水和土壤等环境样品中可培养军团菌定量检测方法，并给出方法的检出限、回收率以及定量计算模式。实际样品结果证明本方法可得出定量结果，凡具备水中军团菌检测条件的基层疾控均可开展该检验项目。

加标实验显示，水和土壤样品检出限分别为1 cfu/mL和10² cfu/g，美国CDC规定水中“存在军团菌”依据为≥10 cfu/mL；文献报道土中军团菌含量约为10²~10⁶ cfu/g^[9]，故本方法检出限值可满足环境样品中军团菌检测。

加标实验中，当水和土壤样品各加入浓度5×10³ cfu/mL标准菌液，即水加标量为10¹ cfu/mL，土加标量为10³ cfu/g时，水样品回收率81%~95%，土样品30%~90%，两类样本回收率范围略有不同。土壤样品回收率不稳定，这与土壤性质有关：一是土壤有机质丰富、杂菌较多且生长速度快，干扰加标菌检出；二是土壤中存在的胶体粒子、土壤颗粒的吸附作用等增加了目标菌的分离难度。环境样品实际检测结果表明，该方法检出限制和回收率水平可以满足目前环境样品定量检测需求。

验证实验结果(表 3)提示：不同处理方式检出菌落数不同，尤其对于土壤样品，会直接影响样品阳性结果^[6]。对于水样品，初步比较后发现不同血清型对于不同处理方式耐受性不同，如LP1型对于热酸处理耐受性较好，而其他血清型军团菌热酸处理后均有部分损耗。因此在方法应用过程中，需按ISO建议的3种处理方式进行检测，任何1种方式的缺失都会影响最终报告结果。

利用本定量检测方法可初步得到环境暴露数据，方法完善与水和土壤中军团菌暴露反应关系的建立有待进一步研究。