分枝杆菌种类较多，可分为结核分枝杆菌复合群(MTC，包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌)、麻风分枝杆菌和非结核分枝杆菌(nontuberculosis mycobacteria，NTM)。NTM可以是致病菌或条件致病菌，广泛存在于自然界，如空气、水、土壤、动物体表及体液等[1]，其引起的非结核分枝杆菌病疫情在世界各地不断爆发流行，在国内也呈现上升趋势[2-3]。目前普遍认为NTM感染是直接接触环境中NTM所致[4]。由于NTM的疏水特性形成的生物膜使其可持续生存于供水系统中[2]，1988年和1997年美国就有城市供水系统发现NTM的相关报道[5-6]。为初步调查6家宾馆饭店水样品中非结核分枝杆菌的存在状况，本研究对自来水、淋浴水等水样品进行分枝杆菌分离培养并采用分子生物学方法进行鉴定。
1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 样品来源样品采集自丰台区宾馆酒店，包括自来水、淋浴水、景观水和冷却水，共计66份样品。
1.1.2 主要试剂罗氏培养管和抗酸染色试剂盒(珠海贝索生物科技有限公司)；快速DNA扩增提取套装试剂盒(天根生化科技有限公司)；引物(Life technologies公司合成)；NaOH等试剂由本实验室配置。
1.1.3 主要仪器离心机(3K15型，SIGMA)；过滤器(DOA-P504-BN，GAST)；PCR仪(icycler，Bio-Rad)；恒温培养箱(MIR-153型，SANYO)；显微镜(CX31，OLYMPUS)。
1.2 方法 1.2.1 样品采集环境水采样方法参照参考文献[7]执行；自来水、淋浴水采样方法参照参考文献[8]执行；各采样点取样均为500 mL，收集后盛于灭菌容器中，4℃保存。
1.2.2 培养前处理将500 mL水样无菌操作倒入真空抽滤装置，通过孔径0.45 μm滤膜抽滤。取下滤膜置于无菌平皿，用5 mL灭菌蒸馏水冲洗后。在平皿中加入等量4% (W/V) NaOH溶液混匀，室温静置20 min，转移液体至15 mL离心管，6000 r/min离心5 min，沉淀用200 μL无菌蒸馏水悬浮。分别取150 μL悬浮液接种到罗氏培养基上。竖直培养，1周后每日观察培养管，分离出不同形态的菌落。罗氏培养管12周无生长为培养阴性。
1.2.3 抗酸染色从罗氏培养管分离的菌落进行菌落涂片，抗酸染色初筛抗酸杆菌。
1.2.4 DNA模板制备对抗酸染色阳性菌落进行核酸提取，置于-20℃保存备用。
1.2.5 PCR扩增16S rDNA片段16S rDNA上游引物SEQ1 5′-CAC AT GCAA GTCGAA CGG AAA GG -3′(位于分枝杆菌16S rDNA 62 -85核苷酸位)和下游引物SEQ2 5′-GCC CGT ATC GCC CGC ACG CT -3′(位于分枝杆菌16S rDNA 626-647核苷酸位)；扩增16S rRNA基因5′端580 bp片段[9]。
1.2.6 PCR产物测序测序方法为单向测序。
1.2.7 核苷酸序列分析所获得的序列通过两种方法进行序列分析：(1) 通过Internet进入www.ncbi.nlm.nih.gov，用BLAST对GenBank核酸数据库进行检索；(2) 通过Internet进入www.ridom-rdna.de，将序列分析结果与数据库中不同菌种的DNA序列作同源性比较。
2 结果 2.1 水样品分枝杆菌培养结果丰台区6家单位采集的66份水样品中，42份分离出非结核分枝杆菌，阳性率为63.6%。
2.2 不同种类水样品的培养采集6家宾馆饭店的自来水、淋浴水、景观水和冷却水，培养后结果见表 1，其中淋浴水的培养阳性率最高，为83.3%。
| 种类 | 样品数(份) | 阳性标本数(份) | 百分率(%) |
| 自来水 | 30 | 15 | 50.0 |
| 淋浴水 | 30 | 25 | 83.3 |
| 景观水 | 2 | 0 | 0 |
| 冷却水 | 4 | 2 | 50.0 |
2.3 抗酸染色结果
对罗氏培养管分理培养的菌落制作菌落涂片，进行抗酸染色后油镜镜检，菌体呈现红色杆状，菌体形状见图 1，判断为抗酸染色阳性。
|
| 图 1 抗酸染色结果图 |
2.4 分子生物学鉴定结果
42份抗酸染色阳性标本，通过分枝杆菌16S rDNA扩增，扩增产物进行电泳，对在580 bp位置条带清晰的产物，测序后进行菌种鉴定。
2.4.1 测序所得到的序列输入网址www.ncbi.nlm.nih.gov，利用BLAST程序对GenBank核酸数据库进行检索，鉴定结果见表 2。
2.4.2 测序所得到的序列
输入网址www.ridom-rdna.de，将序列分析结果与数据库中不同菌种的DNA序列作同源性比较，以Top Score得分最高者确定的种定名，鉴定结果见表 3。不同种类水样品中非结核分枝杆菌的鉴定结果见表 4。
| 种类 | 戈登分枝 杆菌(份) |
偶发分枝 杆菌(份) |
加地斯分 枝杆菌(份) |
阳性标本 数(份) |
| 自来水 | 14 | 0 | 1 | 15 |
| 淋浴水 | 24 | 1 | 0 | 25 |
| 冷却水 | 2 | 0 | 0 | 2 |
| 合计 | 40 | 1 | 1 | 42 |
3 讨论
近年来，NTM引起疾病的报道越来越多，国内外多项研究表明，人可从环境中感染NTM而患病，引起皮肤、肺、淋巴结等感染，水源往往是重要的传播途径[10]。但国内关于环境中NTM分布的流行病学资料尚较少。本文对北京市丰台区6家宾馆饭店的部分水样品进行NTM调查。
病原体的检测方法包括病原微生物的分离培养、免疫学检测和分子生物学方法检测。分子生物学检测技术操作简便、迅速，其原理是基于病原微生物的遗传物质核酸的检测，但不能判断病原体是否存活，是否具有传染性。本文采用分离培养法进行不同种类水样品NTM的调查，以活体病原菌为研究对象，既可以区分既往感染，为研判传染性提供直观依据，又能够获得纯培养物，便于耐药性检测等后续工作的开展。但分离培养法，阳性率偏低，而且环境样品非目的菌种类繁杂，分枝杆菌生长时间长，容易被杂菌污染。本实验在细菌的分离培养环节，部分罗氏培养管中也出现了不同形态菌落的生长，挑取各菌落再次进行分离培养，然后分别进行抗酸染色初筛，淘汰抗酸染色呈阴性的菌落，用PCR方法鉴定抗酸染色呈阳性的菌落，最终确定对应的水样品中是否存在非结核分枝杆菌。因此本文的实验结果仅为定性结果，且个别样品因短时间内杂菌生长旺盛，有掩盖生长较慢的非结核分枝杆菌的可能性，因此实际样品的阳性率可能比本文报告的检出率高。
传统的分枝杆菌生化鉴定耗时且结果准确性受操作人员经验等其他因素的影响，本试验在获得纯培养物后，采用16S rDNA分子生物学鉴定方法，将特异性扩增片段测序，所得序列输入基因数据库，通过序列分析鉴定病原菌。将所得的序列分别输入菌种鉴定常用的国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)数据库和医学微生物核糖体分化RIDOM(http://www.ridom.com)数据库，所得的鉴定结果不同。RIDOM数据库序列来源于临床标本核糖体16S rDNA，大多数种属的序列数据来源于特征十分清楚的多种菌株，尤其是分枝杆菌收集全面，但其它细菌的序列相对较少。Christine等[11]的研究认为, 基于RIDOM数据库的专业网站鉴定非结核分枝杆菌是准确和稳定的。本研究通过RIDOM数据库鉴定结果显示，42份分离培养出非结核分枝杆菌，其中条件致病菌戈登分枝杆菌占95.24%，偶发分枝杆菌占2.38%，加地斯分枝杆菌占2.38%，与陈超等[12]2008年报道的上海市生活饮用水的主要流行株基本一致。
本次调查结果显示淋浴水NTM阳性率83.3%(25/30)，25份阳性样品中24份检出戈登分枝杆菌，占96%；1份检出偶发分枝杆菌，占4%。Falkinhamzai等[13]从同一病人及热水盆样品中分离到鸟分枝杆菌，暴露后紧接着出现的症状和持续时间与暴露时间呈正相关，证明人体暴露于热水盆浴的气溶胶后可发生高敏性肺炎和分枝杆菌肺病。本次调查的不同种类水样品非结核分枝杆菌检出率较高，虽然条件致病菌一般情况下较少直接引起疾病，但对于免疫力低下或免疫受抑制的人群，如艾滋病患者、类固醇服用者、癌症患者、器官移植受者以及儿童等仍能引发感染，存在致病风险，且NTM病与结核病相比无临床特异性，耐药率高，尚无较理想的治疗药物和方法，更体现出预防的重要性。本文的结果仅能说明调查的6家宾馆饭店水样品中非结核杆菌的存在情况，仅为定性结果，水样中非结核杆菌的存在量的多少以及这些非结核杆菌是否可能成为传染源等，相关工作有待于进一步的研究，目前仅见国外文献中有相关研究报道。[1]
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| [2] | 王忠仁, 张宗德, 张本. 非结核分枝杆菌病的流行趋势[J]. 中华结核和呼吸杂志杂志, 2000, 23(5): 263–265. |
| [3] | 吴琪茵, 黎友伦. 非结核分枝杆菌病的流行趋势、诊断及治疗[J]. 中国人兽共患病学报, 2010, 26(5): 491–494. |
| [4] | von Reyn CF, Arbeit RD, Horsburgh CR, et al. Sources of disseminated mycobacterium avium infection in AIDS[J]. J Infect, 2002, 44(3): 166–170. doi: 10.1053/jinf.2001.0950 |
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