苏丹红是一种人工合成的工业染料, 其化学性质为亲脂性偶氮化合物, 主要包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ4种类型。经毒理学研究表明, 苏丹红(Ⅰ)具有致突变性和致癌性, 在多项体外致突变试验和动物致癌试验中发现苏丹红的致突变性和致癌性与代谢生成的胺类物质有关。早在2005年欧盟(EU)等国家在食品中发现苏丹红成分, 包括著名快餐企业肯德基的5种食物中发现了苏丹红成分^[1], 同年我国紧急制定了食品中苏丹红染料的国家标准检测方法, 并开始正式实施, 而在2006年末央视又曝光出"红心鸭蛋事件"^[2], 因此检测食品中苏丹红对于维护食品安全具有重要意义。

《食品中苏丹红染料的检验方法高效液相色谱法》(GB/T 19681–2005)^[3]中规定了测定食品中苏丹红染料的方法, 本文根据实验室现有的仪器设备和条件, 对检测辣椒面中苏丹红的实验条件进行研究, 总结出适合实验室仪器的最佳测试条件, 取得满意的实验结果。

1 材料与方法 1.1 仪器和试剂

1.1.1 仪器

LC-2000高效液相色谱仪, 配有紫外可见光检测器(日本日立公司); XS205DU 1/10万电子天平(瑞士梅特勒—托利多公司); RE52型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂); 商品中性氧化铝层析柱, 6 mL, 进口填料, 国内填装(品牌为SUPERB)。

1.1.2 试剂

乙腈, 丙酮, 正己烷(美国ChromaDex公司, 色谱纯); 甲酸, 乙醚, 无水硫酸钠(均为分析纯)。

1.1.3 标准物质

苏丹红Ⅰ(纯度91.0%)、苏丹红Ⅱ(纯度87.0%)、苏丹红Ⅲ(纯度96.0%)、苏丹红Ⅳ(纯度87.0%), 德国Dr. Ehrenstorfer公司生产。

1.1.4 标准贮备液

分别称取苏丹红Ⅰ(0.0220g)、苏丹红Ⅱ(0.0230 g)、苏丹红Ⅲ(0.0209 g)及苏丹红Ⅳ(0.0230 g)(按实际含量折算后为含有效成分20.0 mg), 先用1.0 mL乙醚溶解后, 再用正己烷定容至100 mL (浓度均为200 μg/mL)。

1.1.5 混合标准应用液

分别取上述浓度均为200 μg/mL标准贮备液各2.00 mL, 用正己烷稀释至10 mL, 配成浓度均为40 μg/mL的混合标准应用溶液。

1.2 样品前处理

1.2.1 提取

准确称取2.000 g(准确至0.001 g)辣椒面样品于三角瓶中, 加入20 mL正己烷, 超声波处理5 min后过滤, 再每次用10 mL正己烷洗涤残渣2次, 直至洗出液无色。

1.2.2 浓缩

合并所有正己烷溶液, 用旋转蒸发仪将正己烷提取液浓缩至5 mL以下。

1.2.3 净化

将浓缩液缓慢加入到氧化铝层析柱中, (为保证层析效果, 在柱中事先保持正己烷液面高度为2 mm左右时上样, 在整个过程中不应使柱干涸)再用正己烷2 mL淋洗浓缩瓶, 合并注入到层析柱中。根据样品中含油类杂质的多少, 继续用10 mL正己烷洗柱, 直至流出液无色, 弃去全部正己烷淋洗液。

1.2.4 洗脱

使用含5%丙酮的正己烷液60 mL洗脱氧化铝层析柱, 收集、浓缩后近干。

1.2.5 定容

最后用正己烷转移并定容至2.5 mL, 经0.45 μm有机滤膜过滤后待测。

1.3 色谱检测条件

色谱柱apollo C₁₈, 5 μm, 4.6 mm×250 mm, GRACE; 流动相:溶剂A, 0.1%甲酸的水溶液及乙腈溶液(V:V=85:15);溶剂B, 0.1%甲酸的乙腈溶液和丙酮溶液(V:V=80:20);柱温:30℃, 采集时间28 min; 检测波长:苏丹红Ⅰ和苏丹红Ⅱ(470 nm)、苏丹红Ⅲ(500 nm)、苏丹红Ⅳ(510 nm); 梯度流速:1 mL/min; 梯度洗脱条件见表 1。

1.4 标准曲线制备

准确吸取浓度为40 μg/mL的苏丹红混合标准应用液(1.1.5) 各0、40、80、160、320、640 μL, 用正己烷定容至10 mL, 此标准系列浓度分别为0、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56 μg /mL, 各进样40 μL, 绘制4种苏丹红的标准曲线。

1.5 样品测定

取经过净化、浓缩的样品处理液进样40 μL, 与标样的谱图对照, 根据峰保留时间定性, 以相应峰面积定量。

1.6 按公式(1) 计算苏丹红含量:

式中:ω—待测样品中苏丹红含量, mg/kg;

   ρ—从标准曲线计算出的样品溶液中苏丹红的浓度, μg/mL;

   V—样品处理液洗脱后定容的体积, mL;

   m—测定用样品的质量, g。

2 结果 2.1 方法的检出限

根据仪器的检出限为3倍噪声除以斜率的值计算后, 苏丹红Ⅰ和苏丹红Ⅱ仪器的检出限均为0.01 μg/mL、苏丹红Ⅲ和苏丹红Ⅳ均为0.008 μg/mL。如果取2.000 g样品提取, 浓缩到2.5 mL体积后测定, 则4种待测组分方法的检出限均为0.01 mg/kg。

2.2 标准曲线回归方程

根据方法的试验条件, 测定浓度范围均为0~2.56 μg/mL的苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ和苏丹红Ⅳ, 标准曲线的回归方程和相关系数结果见表 2。

2.3 苏丹红最大吸收峰的确定

分别取4种苏丹红浓度均为3.3 μg/mL的溶液, 在比色计上进行最大吸收峰的检测, 检测结果如表 3、表 4。

根据测定的最大吸收波长结果, 苏丹红Ⅰ为460 nm、苏丹红Ⅱ为470 nm、苏丹红Ⅲ为500 nm、苏丹红Ⅳ为510 nm。在国标检验方法中^[3], 设定的检测波长为苏丹红Ⅰ478 nm、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ均为520 nm。此次试验根据自己测定的最大吸收峰结果, 结合最佳实验条件, 最后决定将检测波长设定为0~18 min为470 nm、18~22 min为500 nm、22~28 min为510 nm。各组分都得到最佳的灵敏度, 从峰的图形来看, 取得了较令人满意的结果(图 1)。

2.4 各组分的保留时间

从图 1中可以确定苏丹红Ⅰ保留时间为10.77 min, 苏丹红Ⅱ保留时间为16.16 min, 苏丹红Ⅲ保留时间为18.88 min, 苏丹红Ⅳ保留时间为25.04 min并且四种苏丹红得到很好的分离。当用正已烷做试剂空白时, 在18.93 min有一干扰小峰, 与苏丹红Ⅲ的峰很近, 在样品定性时要注意区别, 试剂空白的色谱图见图 2。

2.5 使用的溶剂和梯度洗脱比例

有资料介绍用乙腈为溶剂提取样品^[4], 但正己烷的毒性比乙腈小, 同时对苏丹红的溶解性也更好。本文采用正己烷为溶剂进行样品洗脱。考虑标准与样品的基质成分匹配, 样品采用正己烷定容, 而有的方法是采用丙酮定容^[5]。苏丹红Ⅰ和苏丹红Ⅳ的峰型比较稳定。梯度洗脱比例的设定对苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ影响较大, 比例不合适时, 分离效果不好, 有时峰型变钝, 有时会出现双峰。

图 3是按照国标检验方法^[3]的梯度洗脱表设定得到的色谱图, 苏丹红Ⅲ分离效果不好, 这是由于每个实验室使用的色谱柱不同, 造成出峰的时间也不完全相同, 所以设定梯度洗脱表时, 应按照自己的实际实验条件设置才会取得满意的谱图。

2.6 加标回收率和精密度试验

分别向苏丹红本底值低于检出限的2.000 g辣椒面样品中, 加入0.90、2.00、5.00 μg 3种含量苏丹红的标准物, 按照试验方法进行提取、浓缩后重复测定6次, 最终的加入浓度分别为0.45、1.00、2.50 mg/kg, 计算平均回收率和相对标准偏差(表 5)。

3 分析

本文通过对苏丹红Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ检测方法进行研究, 经过对苏丹红最大吸收波长的测定, 结合梯度洗脱的合适比例, 成功对苏丹红Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ进行分离, 并使实验灵敏度达到最佳状态, 满足实验室对辣椒面中苏丹红的测定。