2. 安徽医科大学公共卫生学院劳动与环境卫生学系;
3. 宁波市疾病预防控制中心环境与职业卫生所
, , , , ,
灭草松, 莠去津, 2, 4-滴、呋喃丹均为农药类化合物, 广泛用于农业、林业中的杂草、杂灌及病虫等有害动植物防治。其用量大、用途广、对人体存在一定毒性[1-2], 可通过农业灌溉、雨水冲刷等途径进入水体。微囊藻毒素是由水体中蓝藻暴发所产生的一种毒素, 其中MC-LR, MC-YR是最常见的两种类型。研究表明微囊藻毒素具有强致肝癌毒性, 并同时具有一定的肾脏毒性、生殖毒性和免疫系统毒性[3-5]。蓝藻爆发, 死亡后大量释放毒素将对水中生物安全及饮用水安全造成危害。
目前, 在我国《生活饮用水卫生标准》(GB 5749–2006)[6]中已将以上6项指标纳入限值管理, 而在配套的《生活饮用水标准检验方法》(GB/T 5750–2006)[7]中, 以上6项指标分为4个标准方法。方法相对独立、繁琐, 已经难以适应大批量及突发应急检测要求。查阅文献表明, 目前这些指标的检测方法主要为液相色谱法[8-9]和液质联用法[10-12], 但多集中于农药或微囊藻毒素单类化合物检测, 同时测定两类多种化合物的方法鲜见报道。在实际样品检测中, 液相色谱法往往存在着样品基体干扰较大、背景值高、定性不准确等问题, 而液相色谱串联质谱法因其选择性强、灵敏度高逐步为痕量农药等残留物质的检测所采用。其中, 超高效液相色谱系统(UPLC)具有分析时间短, 试剂消耗小, 适应大批量、快速检测等优势, 本研究综合参考相关文献, 选择优化实验条件, 建立了水中6种农药和微囊藻毒素化合物的超高效液相色谱—串联质谱(UPLC/MS/MS)同时快速测定方法, 为实际工作应用提供参考。
1 材料与方法 1.1 仪器与试剂Xevo TQ型超高效液相色谱—串联质谱仪(美国Waters公司), 色谱柱:acquity BEH C18(100 mm ×2.1 mm ×1.7 μm)。
甲醇、乙腈(色谱纯, 美国Fisher公司); 甲酸(色谱纯纯, 美国Tedia公司); 实验用水为Milli Q超纯水系统(美国Millipore公司)纯化的纯净水。
标准品:甲醇中灭草松标准溶液(100 μg/mL)、甲醇中2, 4-滴标准溶液(100 μg/mL)、甲醇中呋喃丹标准溶液(100 μg/mL)均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司; 甲醇中莠去津标准溶液(100 μg/mL)、甲醇中微囊藻毒素-RR-LR混标溶液(5 μg/mL)购自美国Sigma公司。
1.2 仪器条件 1.2.1 色谱条件采用梯度洗脱, C18色谱柱分离, 进样量10 μL, 流动相为乙腈和0.1%甲酸水溶液, 流速0.3 mL/min, 柱温40℃, 梯度条件见表 1。
1.2.2 质谱条件
离子化方式:采用电喷雾离子源(ESI), 灭草松、2, 4-滴负离子模式(ESI-), 莠去津、呋喃丹及微囊藻毒素-RR、微囊藻毒素-LR正离子模式(ESI+)。扫描方式:多反应监测模式(MRM)。具体仪器参数:毛细管电压3 000 V, 锥孔电压30 V, 脱溶剂气(氮气)流量800 L/h, 锥孔反吹气(氮气)流量50 L/h, 碰撞气(氩气)流量0.15 mL/min, 离子源温度150℃, 脱溶剂温度500℃。
1.3 标准工作液的配制分别取灭草松、2, 4-滴、莠去津、呋喃丹及微囊藻毒素-RR-LR标准溶液100、100、50、100和400 μL于10.0 mL容量瓶中, 乙腈定容, 制得6种化合物混合标准中间液。临用前, 分别取混合标准中间液10、20、50、200、500 μL用纯水稀释定容至5个10.0 mL容量瓶中, 制得混合标准系列。试剂空白未见干扰, 其它具体相关数值见表 2。
| 化合物 | 国家限值(μg/L) | 标准储备溶液(mg/L) | 混合标准中间液(mg/L) | 标准系列浓度(μg/L) |
| 灭草松 | 300 | 100.0 | 1.0 | 1.0, 2.0, 5.0, 20.0, 50.0 |
| 2, 4-滴 | 30 | 100.0 | 1.0 | 1.0, 2.0, 5.0, 20.0, 50.0 |
| 莠去津 | 2 | 100.0 | 0.5 | 0.2, 0.4, 1.0, 4.0, 10.0 |
| 呋喃丹 | 7 | 100.0 | 1.0 | 1.0, 2.0, 5.0, 20.0, 50.0 |
| 微囊藻毒素-RR-LR(混标) | 1 | 5.0 | 0.2 | 0.2, 0.4, 1.0, 4.0, 10.0 |
1.4 水样采集、前处理和储存
用玻璃磨口瓶采集水样, 自来水水样加40~50 mg/L亚硫酸钠去除余氯, 于4℃冰箱密封保存。若水样混浊则离心取其上清液, 若水样清洁则直接进样, 尽快测定。
1.5 样品测定 1.5.1 定性、定量分析采用直接进样, 并以MRM多反应检测技术结合外标法对6种目标化合物进行定性定量分析(m/z), 具体质谱参数见表 3。
| 组分 | 母离子 | 母离子模式 | 碎片离子(m/z) | 碰撞能量(ev) | 定量离子(m/z) |
| 灭草松 | 238.9 | [M-H]- | 132.2 | 32 | 175.1 |
| 175.1 | 26 | ||||
| 2, 4-滴 | 218.9 | [M-H]- | 125.0 | 32 | 160.9 |
| 160.9 | 16 | ||||
| 莠去津 | 216.1 | [M+H]+ | 96.1 | 24 | 174.1 |
| 174.1 | 18 | ||||
| 呋喃丹 | 222.1 | [M+H]+ | 123.1 | 22 | 165.1 |
| 165.1 | 12 | ||||
| 微囊藻毒素-RR | 519.9 | [M+2H] 2+ | 127.2 | 54 | 135.1 |
| 135.1 | 30 | ||||
| 微囊藻毒素-LR | 498.4 | [M+2H] 2+ | 135.1 | 10 | 135.1 |
| 861.8 | 10 |
1.5.2 分离效果
在实验选定的色谱条件下进行分析, 各待测物峰型较好, 且在各自选定的质谱条件下未见相互干扰。参考保留时间依次为:ESI-灭草松2.99 min、2, 4-滴3.20 min, ESI+微囊藻毒素-RR 2.31 min、微囊藻毒素-LR 2.71 min、呋喃丹2.91 min、莠去津3.12 min(图 1)。
|
| 图 1 6种目标化合物线性最低浓度点标准样品MRM色谱图 |
2 结果与讨论 2.1 实验条件的优化 2.1.1 流动相选择
流动相中加入适量的甲酸可增强ESI+检测的灵敏度, 本文对比了流动相中加入不同体积浓度的甲酸(体积分数分别为0, 0.05%, 0.1%, 0.2 %)对灵敏度的影响。当流动相中甲酸体积浓度为0.05%时, 较未添加时能显著改善其分析灵敏度, ESI+模式下检测的莠去津、呋喃丹及微囊藻毒素-RR-LR峰面积迅速增加; 随着甲酸含量增至0.1%时, 峰面积有一定的增加, 而0.2 %时峰面积无明显变化; 由于甲酸对ESI-模式下的检测物质存在一定抑制作用, 随着甲酸浓度增加, 灭草松、2, 4-滴的灵敏度下降。综合考虑甲酸对不同物质检测灵敏度的影响, 本文选择在流动相中添加0.1%的甲酸。
2.1.2 水样前处理就直接进样而言, 水样的前处理通常有以下3种:① 不处理, 直接进样; ② 采用0.45 μm滤膜过滤, 取滤液进样; ③ 采用高速离心, 取上清液。实验比较了这3种处理方式, 结果表明处理方式①、③ 基本对待测目标化合物无损失, 而处理方式② 对各化合物存在不同程度的损失, 可能与膜吸附有关。兼顾保护色谱柱及工作效率, 故选择方式① 处理清洁水, 方式③ 处理非清洁水。
2.2 标准曲线及方法检出限、检测限、最低检测质量浓度在选定的浓度范围内, 各目标化合物的回归方程均呈较好线性关系(r≥0.999)。以约3倍信噪比计算, 方法的检出限为0.01~0.1 μg/L; 以约10倍信噪比计算, 方法的检测限为0.03~0.3μg/L; 由于本实验为直接进样法测定, 方法最低检测质量浓度即为检测限0.03~0.3μg/L。
2.3 方法的准确度与精密度以自来水为本底, 加标质量浓度为混合标准系列溶液最低、中间、最高质量浓度值(具体加标值见表 5), 样品混匀后, 直接进样法测定, 平行测定6次, 自来水中目标化合物未检出, 本底值以0计算, 回收率范围为98.0%~102.1%, 相对标准偏差为1.73%~3.06%。
| 组分名称 | 线性范围(μg/L) | 回归方程 | 相关系数 | 检出限(μg/L) | 检测限、最低检测质量浓度(μg/L) |
| 灭草松 | 1.0~50.0 | y=1 262.2x-1 489.9 | r=0.9993 | 0.1 | 0.3 |
| 2, 4-滴 | 1.0~50.0 | y=731.4x -53.6 | r=0.9993 | 0.1 | 0.3 |
| 莠去津 | 0.5~25.0 | y=13 277.5x-706.4 | r=0.9992 | 0.03 | 0.1 |
| 呋喃丹 | 1.0~50.0 | y=27 299.1x+10 535.2 | r=0.9992 | 0.01 | 0.03 |
| 微囊藻毒素-RR | 0.2 ~10.0 | y=2 756.1x -128.8 | r=0.9991 | 0.1 | 0.3 |
| 微囊藻毒素-LR | 0.2~10.0 | y=1 045.3x-40.4 | r=0.9994 | 0.1 | 0.3 |
| 注:x表示目标物质量浓度μg/L, y表示目标物峰面积值 | |||||
| 组分 | 最低质量浓度点 | 中间质量浓度点 | 最高质量浓度点 | |||||||||
| 加标值(μg/L) | 测定值(x± s, μg/L) | 平均回收率(%) | RSD(%) | 加标值(μg/L) | 测定值(x± s, μg/L) | 平均回收率(%) | RSD(%) | 加标值(μg/L) | 测定值(x± s, μg/L) | 平均回收率(%) | RSD(%) | |
| 灭草松 | 1.0 | 0.98±0.03 | 98.0 | 3.06 | 5.0 | 5.0±0.11 | 101 | 2.18 | 50.0 | 49.8±0.86 | 99.5 | 1.73 |
| 2, 4-滴 | 1.0 | 1.0±0.02 | 102 | 1.96 | 5.0 | 5.0±0.09 | 99.4 | 1.81 | 50.0 | 50.9±1.06 | 102 | 2.08 |
| 莠去津 | 0.2 | 0.20±0.005 | 99.5 | 2.51 | .1.0 | 0.98±0.02 | 98.0 | 2.04 | 10.0 | 10.1±0.23 | 101 | 2.29 |
| 呋喃丹 | 1.0 | 0.99±0.03 | 99.0 | 3.03 | 5.0 | 5.1±0.09 | 102 | 1.77 | 50.0 | 50.3±0.89 | 101 | 1.77 |
| 微囊藻毒素-RR | 0.2 | 0.20±0.004 | 101 | 1.98 | 1.0 | 0.99±0.03 | 99.0 | 3.03 | 10.0 | 10.2±0.19 | 102 | 1.86 |
| 微囊藻毒素-LR | 0.2 | 0.20±0.004 | 99.0 | 2.02 | 1.0 | 0.98±0.02 | 98.0 | 2.04 | 10.0 | 9.97±0.21 | 99.7 | 2.11 |
2.4 实际水样测定
采用本实验条件和方法, 对安徽省部分地市管网末梢水共50份水样进行检测, 目标化合物均未被检出。
3 结论本研究建立了UPLC/MS/MS法同时快速检测水中灭草松、莠去津、2, 4-滴、呋喃丹、呋喃丹和微囊藻毒素化合物的方法, 该法采用MRM多反应检测技术、灵敏度高、定性准确, 利用用超高效液相, 提高了分析效率, 每个样品仅需6 min; 方法各项技术指标符合《生活饮用水标准检验方法》(GB/T 5750–2006)[7]要求, 操作简便, 适用于以上化合物的同时快速检测。
| [1] | Mishra D, Tiwari SK, Agarwal S, et al. Prenatal carbofuran exposure inhibits hippocampal neurogenesis and causes learning and memory deficits in offspring[J]. Toxicol Sci, 2012, 127(1): 84–100. doi: 10.1093/toxsci/kfs004 |
| [2] | Freeman LE, Rusiecki JA, Hoppin JA, et al. Atrazine and cancer incidence among pesticide applicators in the agricultural health study(1994-2007)[J]. Environ Health Perspect, 2011, 119(9): 1253–1259. doi: 10.1289/ehp.1103561 |
| [3] | Palus J, Dziubałtowska E, Stańczyk M, et al. Biomonitoring of cyanobacterial blooms in Polish water reservoir and the cytotoxicity and genotoxicity of selected cyanobacterial extracts[J]. Int J Occup Med Environ Health, 2007, 20(1): 48–65. |
| [4] | Qiu T, Xie P, Liu Y, et al. The profound effects of microcystin on cardiac antioxidant enzymes, mitochondrial function and cardiac toxicity in rat[J]. Toxicology, 2009, 257(1-2): 86–94. doi: 10.1016/j.tox.2008.12.012 |
| [5] | Anna S. Immunotoxic, genotoxic and carcinogenic effects of cyanotoxins[J]. Centr Eur J Immunol, 2010, 35(2): 105–110. |
| [6] | 中华人民共和国卫生部, 中国国家标准化管理委员会. GB 5749-2006生活饮用水卫生标准[S]. 北京: 中国标准出版社, 2007. |
| [7] | 中华人民共和国卫生部, 中国国家标准化管理委员会. GB/T 5750-2006生活饮用水标准检验方法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2007. |
| [8] | 劳敏华, 欧桂秋. 固相萃取-高效液相色谱法测定水中灭草松、莠去津和2, 4-滴[J]. 净水技术, 2012, 31(2): 72–75. |
| [9] | 薛罡, 杨林, 龚清杰, 等. 高效液相色谱法测定水中微囊藻毒素[J]. 中国给水排水, 2009, 25(22): 90–97. doi: 10.3321/j.issn:1000-4602.2009.22.025 |
| [10] | 郑和辉, 李洁, 魏建荣, 等. 液相色谱串联质谱法直接进样测定水中呋喃丹、草甘膦、灭草松和2, 4-滴[J]. 卫生研究, 2009, 38(3): 302–303. |
| [11] | Loos R, Locoro G, Contini S. Occurrence of polar organic contaminants in the dissolved water phase of the Danube River and its major tributaries using SPE-LC-MS(2) analysis[J]. Water Res, 2010, 44(7): 2325–2335. doi: 10.1016/j.watres.2009.12.035 |
| [12] | Rodrigues MA, Reis MP, Mateus MC. Liquid chromatography/negative electrospray ionization ion trap ms2 mass spectrometry application for the determination of microcystin occurrence in Southern Portugal water reservoirs[J]. Toxicon, 2013, 74: 8–18. doi: 10.1016/j.toxicon.2013.07.013 |