铅是一种重金属毒物，环境中铅普遍存在，特别是在工业发展较快地区的环境和空气中铅的浓度较高。铅可通过呼吸道、消化道、皮肤黏膜等途径进入机体内，对神经、造血、消化、泌尿、生殖系统等多个系统造成损伤，其中慢性铅中毒对神经系统损伤尤为明显，虽然国内外相关研究提出了多种学说，但其具体机制尚无统一定论。研究表明，长期接触铅可导致严重的神经毒作用，造成神经行为障碍和认知能力低下^[1]。亦有文献报道称孕期受低浓度铅暴露可在其后代大脑内蓄积，特别是在大脑发育的早期(如胚胎期)，可导致大脑发育迟缓、不健全，最终影响后代的智力水平^[2]。而长期低剂量接触铅对儿童智力发育的影响也已被广泛认同^[3]。国外有学者研究发现儿童时期受到高浓度的铅暴露会引起严重的神经生理功能障碍^[4]，如运动失调、空间记忆能力低下，最终影响智力，而且这种缺陷几乎是不可逆的。而我国儿童铅中毒形势严峻，据报道我国儿童血铅含量高于100 μg/L的检出率高于发达国家^[5]，城市儿童铅中毒流行率在30%~40%之间^[6]。故本研究通过建立大鼠孕期铅暴露模型，研究其对仔鼠血、海马及大脑皮层铅含量的影响及对其学习能力造成的损伤作用，对预防慢性铅暴露损害儿童智力，促进我国儿童优生优育具有重要意义。

1 材料与方法 1.1 主要试剂

醋酸铅：优级纯，(Sigma公司)；硝酸、高氯酸(重庆川东化工有限公司)；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器

JP-303型示波极谱仪(成都贝斯达仪器有限公司)；Morris水迷宫跟踪系统(成都泰盟科技有限公司)。

1.3 实验动物

体重300±50 g健康SD大鼠，由重庆医科大学实验动物中心提供。

1.4 实验方法

1.4.1 试剂配制 1.4.1.1 醋酸铅饮水溶液

分别准确称量0.2288 g、0.4576 g、0.9152 g醋酸铅，用蒸馏水溶解后定容至1 L，即为125 mg/L、250 mg/L和500 mg/L乙酸铅溶液。

1.4.1.2 铅标准储备液

准确称取1.831 g乙酸铅，用1%硝酸溶解定容至1 L，此为1.00 g/L铅标准溶液。

1.4.1.3 铅标准应用液

吸取铅标准储备液1 mL于100 mL容量瓶中，加水至刻度混匀后吸取10 mL于100 mL容量瓶中，稀释至刻度，此溶液即为1 μg/mL。

1.4.1.4 混合底液

称取酒石酸10 g、碘化钾10 g、抗坏血栓2 g于1 L容量瓶中，再加入浓硫酸5 mL，浓盐酸50 mL，加水定容至刻度，混匀。

1.4.2 动物建模

参考相关研究^[7]将实验动物按雌:雄=1: 1合笼饲养，于次日清晨作阴道涂片镜检，镜检阳性者记为受孕0 d，孕鼠随机分为4组，每组10只分别饲养。暴露组分别给予醋酸铅含量为125、250和500 mg/L的饮水，对照组给予蒸馏水；仔鼠分娩后染毒组母鼠换为蒸馏水直至21 d与仔鼠分笼饲养。分别在仔鼠出生0 d、21 d、60 d时从各个处理组孕鼠的仔鼠中每个处理组均随机选取8只，腹腔注射20%乌拉坦约0.2~0.4 mL进行麻醉，采用一次性无菌注射器取心血并加肝素抗凝。采完断头处理后冰上操作，迅速取出脑组织，分离两侧脑组织中的海马，并取适量大脑皮层额叶固定于4%多聚甲醛中待用。

1.4.3 铅含量测定

将所取的组织称重后置于50 mL三角瓶中，加硝酸5 mL，高氯酸1 mL，混匀后置于电热板上低温消化至百色残渣，加纯水3 mL再烧至百色残渣赶尽烟酸。然后趁热加入10 mL混合底液，充分作用15 min后转入电池杯测定，同时以相同方法制备标准曲线和空白对照样品^[8]。

参数设置：起始电位：-350 mV；终止电位：-1 000 mV；导数：2阶；量程：3；扫描速度：500 mV/s；静止时间：2 s；其余皆为仪器默认设置。

1.4.4 学习记忆功能测定

仔鼠在21、60 d日龄时在各个处理组孕鼠的仔鼠分别进行水迷宫试验，若有不会游泳或者不愿游泳者则剔除后继续随机选取仔鼠直至达到试验所设计的样本量。水池直径1.2 m，高80 cm。试验前一天让其在水迷宫里试游3次，每次1 min；正式试验时水深60 cm(平台在水下1~2 cm)，用奶粉加入水中至水成不透明色，调整水温在25~28℃，前6 d进行定位航行试验，第7 d撤去平台，改为空间探索试验，最大逃逸潜伏期设置为60 s，若其在60 s内找到并爬上平台，则相应地记为Xs，若在60 s内未找到平台，则记为60 s, 并引导其到平台上停留10 s。采取让其头朝水迷宫壁遵循随机的原则从4个象限的任意象限入水，每天进行4次试验^[9]，每次间隔15 min。

1.5 数据处理与分析

数据经双人核对无误后录入，采用SAS 9.13软件包进行分析，采用均数±标准差(x±s)描述各计量值，多组间均数比较先行方差齐性检验，再进行单因素方差分析和两两比较SNK法，对染毒剂量与铅含量、逃逸潜伏期做Pearson相关，若P < 0.05则为差异有统计学意义。

1.6 质量控制

1.6.1 动物饲养

实验中，严格控制光照、温度、喂食等因素，保证各个处理组的饲养条件均衡。

1.6.2 实验过程

在正式试验之前课题组进行全程预实验，保证各个剂量组孕鼠无流产，畸形等情况；水迷宫试验中，剔除不会游泳或者漂浮不动的仔鼠，保证其在60 s内不断寻找平台。示波极谱法测血铅含量时，为避免不同时点环境因素的影响，在测定样本之前均需进行标准曲线的制定。每只孕鼠的幼崽数量在8~15只之间，为保证仔鼠营养一致，减少由于母鼠哺育量不同带来的误差，故将每窝仔鼠调整至8只，仔鼠的筛选原则为尽量保证各个组的仔鼠体重相近、皮毛发育相近。

1.6.3 实验技术

为防止仔鼠生长过程中发生意外，充分保证各个时间点特别是后期的时间点60 d的样本量，每个时间点的每个指标仅选取了8只仔鼠，在60 d时多余的仔鼠均全部进行了相关指标的检测，为使样本量均衡，将样本量统一调至8只。

2 结果 2.1 孕鼠和仔鼠基本情况

2.1.1 孕鼠基本情况

实验期间，各剂量组孕鼠进食量和饮水未出现异常，体重增长情况无显著差异，未出现流涎、过度运动、攻击性行为等铅中毒症状和体征。实验期间各组仔鼠健康状况良好。孕鼠孕期为20~22 d。

各组孕鼠饮水量方差齐性检验F=0.16，P=0.8735，采用单因素方差分析F值为1.91，各组间比较无统计学意义(P=0.1685；表 1)。

2.1.2 仔鼠基本情况

以仔鼠每天体重的增长值为自变量，考查各组别的仔鼠体重增长情况，方差齐性检验F=1. 64，P=0.3465，对其做单因素的方差分析结果F=4.52，P=0.8754，各组无统计学意义(P > 0.05；图 1)。

2.2 孕期铅暴露对仔鼠血铅、海马铅及大脑皮层铅含量影响

各剂量组0、21、60 d仔鼠血铅、海马铅及大脑皮层铅含量均高于相同日龄的对照组，方差齐性检验中各个组资料总体方差齐同，再经SNK两两比较中发现孕鼠铅暴露剂量愈高，仔鼠血铅含量、海马铅含量及大脑皮层铅含量愈高(P < 0.05)；以0 d仔鼠为例，对仔鼠血铅含量与孕鼠铅暴露剂量作Pearson相关分析发现其相关系数r=0.9532，海马铅含量与铅暴露剂量相关系数r=0.8519，大脑皮层铅含量与剂量，相关系数r=0.8933。各个组的仔鼠血铅含量随仔鼠日龄增加均呈下降趋势，而对于海马铅及大脑皮层铅含量，3个染毒组仔鼠的海马铅及大脑皮层铅含量呈下降趋势，对照组则呈上升趋势(表 2)。

2.3 水迷宫试验结果

在21 d仔鼠水迷宫试验中，与对照组相比，3个染毒组子鼠的逃逸潜伏期均明显延长(P < 0.05)，且500 mg/L组子鼠逃逸潜伏期较125 mg/L组显著延长(P < 0.05)，第7 d空间探索试验3个染毒组仔鼠通过平台的次数均少于对照组(P < 0.05)，且孕鼠染毒剂量愈高，仔鼠通过平台的次数愈少(P < 0.05)；以21 d水迷宫试验的第4 d为例，染毒剂量愈高，仔鼠逃逸潜伏期愈长，两者具有良好的剂量反应关系(r=0.8156)。

在60 d仔鼠水迷宫中，与对照组相比，仅500 mg/L组逃逸潜伏期长于对照组(P < 0.05) 且第7 d空间探索试验中通过平台的次数少于对照组(P < 0.05)，而中、低浓度组与对照组已无差异(P > 0.05，表 3和表 4)。

3 讨论

研究中发现母鼠孕期铅暴露后，其仔鼠血铅、海马铅及大脑皮层铅含量显著增加，且母鼠染毒剂量愈高，仔鼠血铅、海马铅及大脑皮层铅含量则愈高；母鼠分娩时，仔鼠血、海马及大脑皮层铅含量达到峰值，这与尹洁等^[10]研究结果类似；在第21 d的水迷宫试验显示，染毒剂量愈高，仔鼠定位航行试验中逃逸潜伏期愈长，空间探索试验通过平台的次数愈少，表明若在初生至断乳期这个神经系统发育完善的关键阶段受到铅暴露，则会影响成熟期后的学习记忆等高级神经行为。具体机制还未完全阐明，铅对海马的影响进而影响学习记忆已被广泛接受^[11]。赵奇等^[12]认为铅导致海马区突触囊泡蛋白(Syn)表达水平降低从而影响学习记忆功能。另外有学者提出铅的神经毒性与其直接促进细胞凋亡、影响神经递质储存释放、脂质过氧化作用有关^[13-14]。而实验中发现染毒组仔鼠大脑皮层铅含量亦明显增加，提示铅暴露还可能通过某种机制影响大脑皮层进而影响学习记忆功能。

研究中还发现染毒组仔鼠海马铅及大脑皮层铅含量随日龄增长而降低，而对照组海马铅及大脑皮层铅含量随日龄增长而增加，这是由于染毒组仔鼠组织中的铅含量相对较高，转移代谢的效果更强；而对照组主要以蓄积作用为主^[15]。随着仔鼠日龄的增长，染毒组仔鼠血铅、海马铅及大脑皮层铅含量均呈下降趋势。在第21 d的水迷宫试验中3染毒组仔鼠定位航行试验中逃逸潜伏期与空间探索试验通过平台的次数均与对照组有差异且高浓度组与低浓度组亦存在差异；而到了第60 d时，中、低浓度组与对照组已无差异且高浓度组与低浓度组之间亦无差异，提示在较低水平铅暴露下，随着仔鼠日龄的增加，其体内的铅的逐渐转移和代谢，铅含量减少的同时其学习记忆能力可有一定程度的好转。表明机体可能通过一定机制部分代偿铅造成的学习记忆损伤。

目前大部分学者均认为儿童铅暴露无阈值^[16]，对神经系统的损伤不可逆，但实验中发现在较低浓度染毒情况下，随着机体对铅的代谢以及仔鼠日龄增长，神经系统进一步发育完善^[17]，对仔鼠的学习记忆功能损伤可能有一定的代偿，但具体的代偿机制以及是否能恢复至正常水平还有待进一步实验证实。