军团菌广泛存在于各种天然和人工水体中，其中嗜肺军团菌是引起人类非典型肺炎的重要病原菌^[1-2]，可经水源传播，引起爆发流行，在公共卫生上意义重大。但军团菌肺炎缺乏典型临床表现，诊断主要依靠实验室检查。传统的细菌培养，特异性好，但培养难度大、阳性率低，仅为50％～60％^[3]。普通PCR、酶联免疫等检测技术，存在检测步骤复杂，耗时长、特异性差的不足，缺乏对环境监测和流行病学调查的必要的敏感性^[4]。而尿抗原检测仅能检测LP1型抗原，且无法确定是新近感染还是既往感染^[5]。

近年来，实时荧光PCR技术以其敏感性高、特异性强及耗时短等优点得到广泛应用。本研究将军团菌属23S rRNA基因^[6]和嗜肺军团菌mip基因^[7]特异性相结合，采用TaqMan探针PCR检测技术，建立一种能同时区分军团菌属及嗜肺军团菌种的快速、敏感、污染小的检测方法，可用于环境调查和各基层医院临床标本的检测。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 菌株

嗜肺军团菌血清1型(legionella pneumophila serogroup 1，LP1，ATCC 33152)、嗜肺军团菌血清3型、5型、部分嗜肺军团菌地方株(未分型)、部分非嗜肺军团菌地方株(未分型)；阴性对照肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、弗氏柠檬酸杆菌、空肠弯曲杆菌、脑膜炎奈瑟菌、粘质沙雷菌、阿贡那沙门菌、肠炎沙门菌、副溶血性弧菌为本院实验室提供。

1.1.2 试剂和仪器

军团菌培养基基础粉及BCYE生长添加剂(友康基业生物科技北京有限公司)；细菌基因组DNA提取试剂盒、各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶和dNTPs(大连Takara公司)；琼脂糖和pGEM®-T载体(美国Promega公司)；荧光定量PCR仪(TL 988型，西安天隆科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株培养

取ATCC 33152菌株划线接种于军团菌(BCYE)生长培养基上，放入恒温箱，CO₂浓度5%，温度37℃，湿度80%，孵育3～5 d。取单个菌株传代培养，培养平皿菌液用于提取DNA。

1.2.2 引物与探针设计

选定军团菌属23S rRNA基因，和嗜肺军团菌mip基因的保守序列设计引物和TaqMan探针(表 1)。送上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.3 DNA模板制备

取菌液1 mL，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，作为模板。

1.2.4 嗜肺军团菌的稀释与计数

取菌量为n×10⁸ cfu/mL(用活菌计数办法估算)的LP1菌液，10倍系列稀释，用各浓度稀释液100 μL涂布培养基，每稀释度做3个平皿，培养5 d后计数。同时取不同稀释度的菌液各1 mL，提取DNA为模板，用做PCR敏感性试验。

1.2.5 标准质粒的构建

以ATCC 33152菌株为模板，分别扩增23S rRNA、mip目的基因，PCR产物纯化回收，连接至pGEM®-T载体，挑取阳性克隆转化至DH5a大肠杆菌中，经蓝白筛选，选择合适菌落提取质粒DNA进行酶切及序列测定，鉴定插入序列，并测定质粒DNA浓度，进行拷贝数的换算。构建2个标准质粒：pUC-Lp-23S、pUC-Lp-mip。

1.2.6 TaqMan探针PCR实验条件的优化

PCR反应时同一模板按2个引物各自反应体系分别配制，双管同时检测，反应条件相同。因TaKaRa公司的荧光定量PCR试剂反应预混液已为最优化，所以本研究对引物和探针用量、热循环参数进行优化，以达到最佳扩增效率。

1.2.7 荧光定量PCR方法验证 1.2.7.1 敏感性检验

分别取梯度含量的质粒标准品进行方法敏感性检测，每个PCR反应中标准品质粒拷贝数依次为10⁰～10⁶个。同时，将1×10⁶ cfu/mL的菌液提取DNA，对不同稀释度进行方法敏感性评价。

1.2.7.2 特异性检验

对6株嗜肺军团菌、6株非嗜肺军团菌及18株其他菌株提取DNA，验证方法的特异性。

1.2.7.3 重复性检验

取3个不同稀释度质粒标准品，对每个稀释度作3次重复检测，计算Ct值的变异系数(C_v)验证检测体系的稳定性。

1.2.8 PCR阳性结果判定 1.2.8.1 普通PCR

电泳条带明显者为阳性，不明显者为阴性。

1.2.8.2 荧光定量PCR

Ct值小于35且扩增曲线良好可直接判定为阳性，Ct值35～37之间需要重复实验，2次实验均能得到良好S型扩增曲线方可判定为阳性。

1.2.9 环境水样及痰样的处理 1.2.9.1 环境水样的处理

取环境水样500 mL，无菌滤纸过滤后，用装有0.3 μm孔径醋酸纤维滤膜的过滤器过滤，剪去滤膜的外围受压部分，将膜转移到灭菌塑料离心管内，加入2 mL灭菌蒸馏水，充分振荡，取1 mL，用试剂盒提取DNA，共35份水样。同时另取同样的水样500 mL送石家庄市疾病预防控制中心做军团菌的菌培养，共35份。

1.2.9.2 模拟痰样的处理

刮取适量LP1菌落于1 mL无菌蒸馏水中，以10倍系列稀释法制成不同浓度的细菌悬液，做活菌计数。将不同浓度的LP1 细菌悬液加入到TaqMan探针PCR结果阴性的临床标本中制成模拟痰标本。Saccomanno液与DTT液等体积混合，1～2倍体积加入到模拟痰样中，震荡液化30 min。用试剂盒提取DNA。

1.2.9.3 临床痰样的处理

Saccomanno液与DTT液等体积混合液按上述方法处理痰样及制备DNA。

2 结果 2.1 PCR最优反应体系和优化的反应条件

最优反应体系见表 2，总反应体积为25 μL(冰上配置)。

2.2 灵敏度

2.2.1 标准质粒灵敏度

不同稀释度标准质粒做荧光PCR检测，生成扩增曲线(图 1)，并绘制标准曲线(图 2)，23S rRNA基因检测、mip基因检测标准曲线的相关系数R²分别为0.996、0.990，表明不同浓度质粒标准品在标准曲线上的数据点与曲线拟合良好，最低可检测到10拷贝数/反应载量的质粒标准品。

2.2.2 利用活菌进行评价

分别取10^-2～10^-7稀释度的LP1菌液涂板，菌落计数相应为3 562、690、70、8 cfu/mL。不同稀释度菌液分别提取DNA，用普通PCR和荧光PCR进行检测，普通PCR灵敏度达690 cfu/mL(图 3)。而荧光PCR方法可检测到8 cfu/mL。可见，荧光PCR方法较普通PCR方法灵敏度高。

2.3 特异性

所有嗜肺军团菌23S rRNA基因检测及mip基因检测均为阳性，非嗜肺军团菌23S rRNA基因检测阳性而mip基因检测阴性，而其他非军团菌两种基因检测均呈阴性结果，可见本方法具有良好的特异性。

2.4 重复性

3个稀释度质粒标准品配制反应体系(102拷贝数/反应、103拷贝数/反应、104拷贝数/反应)，每个稀释度分别做3次重复检测，结果23S rRNA基 因检测Ct值的变异系数分别为1.235%、2.059%和2.136%；mip基因检测Ct值的变异系数分别为1.153%、1.871%和0.748%。

3 方法的应用 3.1 环境水样的检测

用该方法对采集的35份环境水样进行检测(表 3)，结果检出3株非嗜肺军团菌和3株嗜肺军团菌，经重复测定结果相同。而所有水样经传统分离培养法和普通PCR法检测均显示为阴性。

3.2 痰样的检测

用该方法对不同稀释度菌液模拟痰样检测，菌量为10² cfu/mL及以上浓度的模拟痰样均可检出，再低浓度未见荧光。

对临床80份随机痰液标本进行检测，2份23S rRNA基因检测及mip基因检测均阳性，而其余标本均阴性。对此2例检测阳性患者随访：1例为住院患者，中年男性，诊断为“肺炎”，检测结果回报后即给予左氧氟沙星治疗，治疗半月症状消失，肺部病灶明显吸收，出院；1例为门诊患者，表现为干咳、肌肉酸痛、乏力，门诊给予服用阿奇霉素治疗，治疗7 d后症状消失。

4 讨论

军团菌属数量庞大，致病菌90%以上为嗜肺军团菌^[2]。因此，区分嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌有非常重要的临床意义。本研究采用军团菌属23S rRNA基因和嗜肺军团菌种mip基因保守序列设计引物和探针，建立了一个具有高度特异性和敏感性、能同时区别军团菌属和嗜肺军团菌种的快速检测方法。该方法对PCR仪器要求不高，普通单通道PCR仪即可实现检测，使基层医院开展军团菌的定量检测成为可能。

本研究所建立的标准质粒，最低能检测到10拷贝数/反应体系；比普通PCR灵敏度高，与国外报道结果一致^[8]。荧光定量PCR从根本上解决了普通PCR扩增产物污染和不能定量的问题。本方法具有引物和探针双重特异性，不与其他细菌发生交叉反应，稳定性好，检测快速，整个过程可在2 h内完成。

经验证，本研究建立的方法可用于临床标本检测和环境水源污染情况的调查，对军团菌病的早期诊断、疗效观察和环境监测提供了有效的手段。本次调查石家庄民心河军团菌检出率达80%、嗜肺军团菌检出率40%，分体空调军团菌检出率20%、嗜 肺军团菌检出率10%，自来水及浴室喷头未有军团菌检出。说明环境水源中军团菌普遍存在，而随着经济发展，空调、热水器等人工水环境越来越普及，军团菌污染对人群健康的潜在威胁将越来越重。本研究临床痰标本检出率为2.5%，考虑到痰液为随机抽取，未区分社区获得性与医院获得性，但也说明军团菌是本地区肺炎患者的病原体之一，应引起临床医生的警惕。