2. 中国环境科学研究院
, Yu Yunjiang1,2
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四溴双酚A(TBBPA)作为溴代阻燃剂被广泛应用于塑料、电子产品、建筑材料和纺织品中，近年来，随着TBBPA在水体、沉积物和大气等环境介质，以及水生物、野生动物和人体血液、母乳样品中的广泛检出[1-4]，国际上对其可能造成的环境危害以及对人体健康的影响开始日益关注。目前有关TBBPA毒性研究的报道逐渐增多，对其肝肾毒性[5-6]、免疫毒性[7]、神经毒性[8]和内分泌干扰效应[9]等有了初步认识，但有关其细胞毒性及其剂量—反应关系尚不完全清楚。本研究以不同质量浓度的TBBPA染毒HepG2细胞，通过观察细胞形态、检测细胞存活率以及测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出率探讨TBBPA的细胞毒性；采用基准剂量(BMD)法和未观察到有害作用剂量水平(NOAEL)法对其剂量—反应关系进行评估，探索体外分析方法在化学品健康风险评估中的应用。
1 材料与方法 1.1 细胞株与主要试剂人肝癌细胞株(HepG2) 购至中国科学院细胞库；TBBPA购于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，纯度大于98%；DMEM高糖培养基、胰蛋白酶(0.25%，含EDTA)、胎牛血清购于Gibco公司(美国)；青霉素、链霉素购至华北制药股份有限公司；MTS检测试剂盒购至Promega公司(美国)；LDH检测试剂盒购至江苏省海门市碧云天生物技术研究所。
TBBPA母液配制：称取TBBPA 108.8 mg，高压灭菌后溶于2 mL DMSO配制成100 mmol/L母液。给药时将母液溶于细胞培养液分别调至所需处理质量浓度，培养液中DMSO最终质量浓度不超过0.1%，不会对细胞产生影响[10]，因此不需要设置DMSO溶剂对照。
HepG2细胞培养液配制：DMEM高糖培养基500 mL，加FBS 50 mL，加双抗(终质量浓度为青霉素100 U/mL，链霉素100 μg/mL)，4℃保存备用。
1.2 细胞培养与形态学观察HepG2在含l0%胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养，培养条件为5% CO2，37 ℃，饱和湿度。细胞培养过程中，每日在倒置相差显微镜下观察，注意培养液有无浑浊、污染、细胞漂浮死亡等现象。每2~3 d传代1次。
细胞生长稳定后，调整细胞密度为1×105 cells/mL，接种于24孔板中，每孔400 μL培养液。培养24 h后，吸弃原培养液，每孔加入终质量浓度为0、10、20、30 μmol/L的TBBPA 400 μL，每个质量浓度设4个重复。作用24 h后，光学显微镜下观察细胞形态的变化并拍照记录。
1.3 细胞存活率测定细胞存活率是细胞毒性实验常用指标，本研究采用MTS检测试剂盒以比色法测定细胞存活率。调整细胞密度为1×105 cells/mL，接种于96孔板中，每孔100 μL，细胞培养24 h后，吸弃原培养液，每孔加入终质量浓度为0、2.5、5、10、15、20、25、30、35、40 μmol/L的TBBPA 100 μL，每个质量浓度设4个重复。分别作用12、24、48 h后，每孔加入20 μL MTS试剂，继续孵育1 h后，选择490 nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光度(OD)值。细胞相对存活率计算公式为：
| ${\rm{细胞相对存活率 = }}\frac{{OD\rm{样品} - OD\rm{本底}}}{{OD\rm{对照} - OD\rm{本底}}} \times 100{\rm{\% }}$ |
乳酸脱氢酶(LDH)是稳定的胞浆酶，存在于所有的活细胞中，当细胞膜损伤时则释放到细胞培养液中，通过检测细胞培液上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度。本研究采样LDH检测试剂盒检测LDH漏出率。调整细胞密度为1×105 cells/mL，接种于24孔板中，每孔400 μL，细胞培养24 h后，吸弃原培养液，每孔加入终质量浓度为0、10、20、30、40 μmol/L的TBBPA 400 μL，每个质量浓度设4个重复。分别作用12、24、48 h后，按照说明书要求依次加入LDH检测试剂，450 nm处测定OD值。LDH漏出率计算公式为：
| ${\rm{LDH{漏出率}(}}\%{对照} ){{ = }}\frac{{OD{样品}{{ - }}OD{空白}}}{{OD{对照}{{ - }}OD{空白}}} \times {{100}}\% $ |
选择TBBPA染毒24 h对HepG2细胞抑制率为健康效应终点，根据TBBPA染毒24 h细胞存活率测定结果，分别采用BMD和NOAEL法评估TBBPA的剂量—反应关系。剂量—反应关系的模型拟合，基准剂量(BMD10) 和基准剂量下限(BMDL10) 的计算均通过U.S.EPA开发的BMDS 2.2进行。NOAEL定义为与对照组相比，HepG2细胞的抑制率最低未产生显著性差异的TBBPA处理质量浓度；最低观察到有害作用剂量水平(LOAEL)定义为与对照组相比，HepG2细胞的抑制率产生显著性差异的最低TBBPA处理质量浓度(P小于0.05)[10]。
1.6 统计分析实验数据以均数±标准差(
不同质量浓度的TBBPA作用HepG2细胞24 h后，显微镜下观察显示，正常的HepG2细胞成团贴壁生长(A)；10 μmol/L TBBPA处理组，少数细胞有萎缩变圆现象(B)；20 μmol/L TBBPA处理组，部分细胞开始萎缩变圆(C)；30 μmol/L TBBPA处理组，细胞萎缩变圆效应明显，并出现大量的漂浮细胞碎片(D, 图 1)。
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| 图 1 TBBPA染毒24 h对HepG2细胞形态的影响( ×200) |
2.2 TBBPA对HepG2细胞存活率的影响
由图 2可以看出，随着TBBPA作用质量浓度升高，HepG2细胞存活率相应降低；随着作用时间的增加，TBBPA对HepG2细胞存活率的抑制作用增强，HepG2细胞存活率与TBBPA处理呈质量浓度—效应关系和时间—效应关系。另外，采用概率单位法[11-12]计算其半数抑制质量浓度(IC50)，12、24和48 h的IC50分别为33.82、27.36和17.73 μmol/L。
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注：与对照组相比，*P小于0.05，**P小于0.01( |
2.3 TBBPA对HepG2细胞LDH漏出的影响
LDH漏出率测定结果显示(图 3)，低剂量(10 μmol/L)TBBPA处理12、24、48 h的HepG2细胞LDH漏出与对照组相比均无显著性差异(P大于0.05)，12 h染毒后30和40 μmol/L处理组，24和48 h染毒后20、30和40 μmol/L处理组细胞LDH漏出与对照组相比显著增加(P小于0.01)，表明TBBPA能导致HepG2细胞的细胞膜损伤。
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注：与对照组相比，*P小于0.05，**P小于0.01( |
2.4 剂量—反应关系评估
根据统计学显著性差异的判定标准，TBBPA各处理质量浓度对HepG2细胞的抑制率(抑制率=100%-存活率)在2.5、5和10 μmol/L剂量组，反应无显著性差异，在15 μmol/L剂量组，反应有显著性差异，因此10 μmol/L被认定为NOAEL，15 μmol/L被认定为LOAEL(图 4A)；根据BMDS软件计算结果，TBBPA染毒24 h致HepG2细胞毒性的BMD 10和BMDL 10分别为10.34 μmol/L和9.45 μmol/L(图 4B)。
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注：与对照组相比，*P小于0.05，**P小于0.01( |
3 讨论
HepG2细胞是从人肝胚细胞瘤分离出的细胞株，保留了肝细胞的许多特性，本身具有完整的人类代谢活化Ⅰ相、Ⅱ相酶，能模拟体内代谢环境，并且酶活性较稳定，不会随传代次数增加而降低[13]，使受试化合物测试结果的准确性和可重复性较高；同时，该细胞株源于人体，可以减少从动物实验或动物源细胞株的测试结果向人外推的不确定性，反应作用过程更接近人体内，使实验结果具有较高可靠性。
已有研究表明，TBBPA对哺乳动物具有肝脏毒性，会导致小鼠肝细胞肿大、炎症细胞浸润和肝细胞坏死，可能会诱导肝损伤[5-6]；据Boecker等[14]的研究，TBBPA会通过破坏线粒体而对肝原代细胞产生毒害作用。本研究结果显示TBBPA对HepG2细胞具有明显毒性，表明TBBPA可能具有潜在的肝毒性风险，这与文献报道结果相一致，然而本研究直接以人源的细胞系进行测定，减少了从动物实验或动物源细胞分析结果向人体毒性效应外推的不确定性，结果更为准确和可靠。另外，Strack等[15]的研究显示，TBBPA暴露24 h后，大鼠肾细胞NRK、人肺细胞A549、人甲状腺细胞Cal-62的细胞存活率显著降低，其半数效应质量浓度(EC50)分别为52、168和200 μmol/L，相比该研究结果，TBBPA暴露24 h后HepG2细胞的IC50为27.26 μmol/L，表明HepG2细胞对TBBPA暴露更加敏感。
化学品风险评估中的剂量—反应关系研究一直以来都主要依赖动物实验，然而用动物模型来进行化学品风险评估，往往耗时长且价格昂贵[16]，并且在由动物实验结果外推人类健康风险时存在着一定的种间不确定性[17]。体外分析方法由于可以直接采用人源的细胞，从而减少了从动物实验向人外推的不确定性；同时，采用体外细胞模型可以测试更广泛的剂量水平，能更好的了解低剂量暴露对人体健康的影响，还可对其毒性机理进行研究。目前，大量的体外测试方法已经被OECD所采用，如用于皮肤腐蚀、皮肤光毒性和经皮肤吸收的测试已经被欧盟法规采纳并成为67/548/EEC指令的一部分[18]；U.S.EPA也在推进细胞毒性测试在风险评估中应用[19]。本研究基于TBBPA细胞毒性分析结果，对其剂量—反应关系进行了评估，探索了体外分析方法在化学品健康风险评估中的应用，也为TBBPA进一步的毒性评估提供了基础数据。
传统的剂量—反应关系评估是根据NOAEL与不确定系数(UF)的比值(NOAEL/UF)得出参考剂量(RfD)，这种方法具有一定的局限性，如NOAEL法只强调没有观察到有害作用的剂量，忽略了剂量—反应曲线的形状，不能确定一定剂量尤其是高于RfD所产生的风险等[20]。BMD法由Crump于1984年最先提出[21]，1995年U.S.EPA将其引入健康风险评估[22]，并最先于IRIS中开展应用[23]。相比NOAEL法，BMD法具有对实验剂量、样本量的依赖性低，结果可靠等优点[20]。本研究中，BMD法将所有的剂量—反应关系数据拟合为剂量—反应曲线，并通过可信区间下限值(BMDL 10) 来说明数据的变异性及不确定性，相比NOAEL法仅用一组实验数据得出评估结果，结果更为可靠，因此BMDL 10=9.45 μmol/L为剂量—反应关系最终评估结果。
在化学品健康风险评价中，从体外研究得出的结论一般不能直接应用于体内情况，基于细胞毒性的剂量—反应数据需向体内剂量—反应外推。Verner等[24]在对PBDEs人体风险评估中的体外神经毒性数据研究中指出，基于细胞测试的剂量—反应向体内外推，首先需将培养液中的PBDEs质量浓度转化成细胞质量浓度，这需要考虑PBDEs的生物累积性；然后采用不确定系数将基于细胞毒性水平的剂量—反应向体内靶器官或组织水平外推。本研究得出了TBBPA致HepG2细胞毒性的NOAEL、LOAEL、BMD 10和BMDL 10，为TBBPA进一步的毒性评估和健康风险评估提供了基础数据。
4 结论TBBPA能引起HepG2细胞形态变化和存活率降低，导致HepG2细胞的细胞膜损伤，表明TBBPA具有明显的细胞毒性；TBBPA暴露24 h后，以HepG2细胞的抑制率作为健康效应终点，其基准剂量为9.45 μmol/L。
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