2009年全球暴发的甲型H1N1流感是由一种新型人感染猪源性甲型H1N1流感病毒所致，主要通过呼吸道飞沫、空气和接触病毒污染物传播，其临床表现及预后与季节性流感并无明显不同^[1-2]，但本次流感传播速度快、范围广，动物实验研究已经证实导致此次流感的新型甲型H1N1流感病毒较季节性流感具有更强的感染力^[3-4]。我国已将甲型H1N1流感纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，并采取甲类传染病的预防、控制措施，将甲型H1N1流感纳入《中华人民共和国国境卫生检疫法》规定的检疫传染病管理^[5]。

面对如此严峻形势，甲型H1N1流感病毒的检测工作显得尤为重要，而选择适合的检测试剂更是保证检测结果准确可靠的重要前提。当前，甲型H1N1流感病毒检测试剂层出不穷，为了解甲型H1N1流感病毒检测试剂的实际应用效果，本试验选用4种试剂盒，其中包括3种原卫生部推荐试剂盒和1种非官方推荐试剂盒，对本地哨点医院采集的286份甲型H1N1阳性标本(河南省疾病预防控制中心已用3种原卫生部推荐试剂盒复核)进行检测，比较不同试剂盒之间的差异，为检测时选用试剂提供数据支持和理论依据。

1 材料与方法 1.1 标本来源

鼻咽拭子标本286份，从流感监测哨点医院(开封市第一人民医院)采集的甲型H1N1阳性标本中随机抽取。标本的采集、运送和保存依据原卫生部《甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案》^[6]执行。

1.2 主要试剂

病毒检测用RNA提取试剂盒(离心柱型)，(批号：17417)，购自TIANGEN公司；甲型H1N1流感病毒RNA检测试剂盒(荧光RT-PCR法)：试剂盒A(批号：200909099)、试剂盒B(批号：20091006)、试剂盒C(批号：20091001)、试剂盒D(批号：20090901，20091102)，均在有效期内使用。

1.3 主要仪器

iQ5实时荧光定量PCR仪(美国伯乐公司)；BHC-Ⅱ A/B3生物安全柜(苏州安泰空气技术有限公司)；1-15K台式离心机(Sigma公司)。

1.4 检测环境及方法

检测环境为国家级流感监测网络实验室(二级生物安全实验室)，具有检测和比对的资质和能力。

检测方法参照原卫生部《甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案》^[6]。

1.4.1 病毒核酸提取

按RNA试剂盒(TIANGEN公司)说明书进行操作提取病毒核酸。

1.4.2 扩增检测

采用Real-time RT-PCR法对目的基因片段进行扩增检测，所用引物的名称和序列见表 1。

1.4.3 结果处理

读取检测结果，记录样品Ct值，按照试剂说明书进行结果判断，Ct≤37.0，判断为阳性，对37.0＜Ct＜40.0的样本进行复检，复检结果Ct＜40.0的样本为阳性，否则为阴性。分别对4种试剂盒的检测数据进行方差分析及SNK检验，所有分析均采用SPSS 13. 0统计软件进行处理。

1.5 质量控制

实验中将RNAseP作为采样和核酸提取的质控指标，检测时做阴性和阳性对照(由国家流感中心提供)。实验操作均在二级生物安全实验室进行。实验完成后进行消毒，废弃物必须经过高压灭菌后，按医疗垃圾物处理。

2 结果 2.1 4种试剂盒检出阳性率比较

4种试剂盒对286份鼻咽拭子标本的检测结果见表 2。由表 2可知，4种试剂盒中以试剂盒A和试剂盒C检出阳性率最高，试剂盒B次之，试剂盒D最低。

2.2 4种试剂盒的方差分析及SNK检验结果

对4种试剂盒检测286份鼻咽拭子标本的数据进行方差分析SNK检验，结果用字母标记法^[7]表示(表 3)。由表 3可知，对指标1，试剂盒D和试剂盒C的检测效果差异性不太显著，但显著高于试剂盒A和试剂盒B；对指标2，试剂盒C和试剂盒A的检测效果差异性不太显著，但显著高于试剂盒B和试剂盒D；对指标3，试剂盒A、B和试剂盒C的检测效果无显著差异，但显著高于试剂盒D；对指标4，试剂盒A、C和试剂盒D的检测效果无显著差异，但显著高于试剂盒B；对指标5，试剂盒C的检测效果显著高于试剂盒A、B和试剂盒D。

3 讨论

2009年4月中下旬，美国、墨西哥和加拿大等相继发现甲型H1N1流感病毒引起的呼吸道感染性疾病，随后疫情迅速蔓延。为积极应对甲型H1N1流感疫情，国家流感中心完善了流感监测网络，本实验室也被纳为国家流感监测网络实验室，人员培训上岗，检测方法严格按照国家流感监测中心的技术方案，所用检测试剂均由国家流感中心统一配发或指定，和国内其它流感监测网络实验室处于同一水平。

与原有的金标准—经典的MDCK细胞病毒分离法相比，荧光定量RT-PCR法通过在PCR反应体系中加入TaqMan荧光探针进行实时监测，提高了检测的灵敏度与特异性，既缩短了出结果的时间，又大大减少了出现假阳性的可能，是病毒鉴定的发展方向。目前，国家流感监测各网络实验室均采用荧光PCR方法检测流感病毒，而且国内对各试剂盒检测效果的对比时有报道。张洪英等^[8]比较了达安基因的甲型H1N1试剂及美国疾病预防控制中心的甲型H1N14对引物法的检测效果，证明其有高度的特异性。另外，成都疾控中心对167份流感样标本同时采用两种荧光PCR核酸检测试剂，比较了两种荧光PCR试剂盒对甲型H1N1流感检测结果的差异，为结果的解释和试剂的选择提供参考^[9]。

本试验选用4种甲型H1N1流感病毒检测试剂盒进行对比分析。从本次试验结果可见，不同的检测试剂盒其检测阳性率是不同的，官方推荐的3种试剂盒中，试剂盒A和试剂盒C的检出阳性率最高，试剂盒B略低，而非官方推荐的试剂盒D检出阳性率最低。经方差分析SNK检验，4种检测试剂盒对每个指标的检测效果都存在显著性差异，说明在扩增效率上有所不同。相比之下，试剂盒A、B和C的检测效果较好，可被推荐用于甲型H1N1流感病毒的检测，而试剂盒D的检测效果次之，技术上需要进一步改进和完善。另外试剂盒C具有较高的灵敏性，更适宜用于甲型H1N1流感病毒的初筛。这一结果还提示，在实际工作中需要对试剂盒进行检测效果评估，通过比较选择更为灵敏可靠的试剂，为疾病防控工作提供准确的实验室依据。

结合实验室情况对本组试验结果进行分析。首先，本次试验中核酸提取使用的是北京天根生化科技有限公司生产的提取试剂盒，由于未和4种荧光PCR试剂配套的提取试剂盒一起使用，可能会对试验结果有影响，但为了保证提取效率一致，均未采用各自配套的提取试剂盒。其次，流感病毒检测工作人员均应经过严格培训，规范操作，避免污染，以保证结果判断准确。第三，本组标本量有限，而且样品均为强阳性标本, 可能影响试剂盒差异性结果的体现。

由于不同试剂盒检测的灵敏度与特异性有所差异，因此试剂研发公司与检测机构应搞好联合，加强科研攻关力度，增加流感病毒诊断新技术与治疗新方法的研究投入，为流感的快速诊断与防治提供强有力的技术支撑。