, , Wang Qiang
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钼(Mo)是人体必需的微量元素, 是黄嘌岭氧化酶、醛氧化酶、亚硫酸氧化酶的组成成分, 参与电子传递及铁的释放与运输, 影响多种物质的代谢, 具有重要的生物学功能。适量的钼能减少心血管疾病的发生, 具有抗氧化、抗癌、增强机体免疫力的作用, 但过量的钼则可以引起免疫器官病理损伤, 免疫功能下降[1-3]。目前, 有关钼对动物免疫功能的影响研究较少。本研究以小白鼠为研究对象, 旨在通过探索钼对体外抗体形成细胞(Plague Forming Cell, PFC, 其实质是B淋巴细胞)、巨噬细胞吞噬功能等的影响, 从免疫学角度为钼的环境控制和钼缺乏的防治提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物及试剂昆明种雄性健康小白鼠45只, 体重19 ~ 23 g, 由本校实验动物中心提供; 钼酸钠(Na2MoO4)(天津市化学试剂四厂生产), 根据前期预试验结果将其饮水配制成20 mg/L、500 mg/L, 分别定义为低剂量钼和高剂量钼。将小白鼠随机分为3个组, 每组15只; 各组基础日粮相同, 同组同笼饲养, 在饮水中加入不同剂量的钼:空白对照组、低剂量钼组(20 mg/L)和高剂量钼组(500 mg/L)。
1.2 检测指标及方法 1.2.1 脾脏重量和生长指数的测定每隔7 d从每组随机抽取5只剖杀, 剖杀前空腹称重, 剖杀后立即取脾脏称重, 计算脾脏生长指数:脾脏生长指数=免疫器官重量(mg)/体重(g)。
1.2.2 吞噬细胞功能检测[4]第11 d经小白鼠腹腔注射6%淀粉肉汤1 mL, 刺激小白鼠产生无菌性炎症, 诱导巨噬细胞的聚集, 活化。3 d后腹腔注射1%鸡红细胞1 mL, 30 min后注射2 mL Hanks液, 颈椎脱臼法处死小白鼠, 解剖小白鼠暴露腹腔, 用尖吸管尽可能多地冲洗出小白鼠腹腔的吞噬细胞, 并取脾脏称重。收集腹腔液, 置于洁净试管内, 加1 ~ 2滴1%碱性美兰染色, 涂片于载玻片上, 37℃温箱干燥, 油镜镜检, 计算吞噬百分比或吞噬指数:
| $ \text{吞噬百分率}=\frac{\text{吞噬鸡}RBC\text{的巨噬细胞数}}{\text{100个巨噬细胞}}\text{ }\!\!\times\!\!\text{ 100% } $ |
| $ \text{吞噬指数=}\frac{\text{100个巨噬细胞吞噬的鸡}RBC\text{总数}}{\text{100个巨噬细胞}} $ |
取无脂载玻片(75 mm×25 mm), 用双面胶带在载玻片两端和中间各粘一条, 然后再覆盖上同样的载玻片, 即形成两个小室。将此双层玻片的一侧长边浸入融化的石腊池中以封闭小室的一边。
第17 d将5%绵羊红细胞0.4 mL(约4×106个)注射入小白鼠腹腔, 4 d后拉脱颈椎处死, 取出脾脏称重后放在已加入6 mL Hanks液的平皿中, 用100目的不锈钢网研磨后, 经尼龙布过滤放入试管中, 1 000 r/min离心5 min, 洗2次。将沉淀的脾细胞重悬Hanks液中, 细胞计数配成1×107/mL。将上述脾细胞Hanks液50 μL、15% SRBC 50 μL、1:6 ~ 1:8补体50 μL、Hanks液250 μL混匀, 用微量加样器将混合液注入事先制备好的小室中(每小室100 μL), 然后以石蜡封口, 放37℃温箱1h, 取出。借助放大镜, 进行空斑计数, 计算1×106个脾细胞所含空斑数。
1.3 统计学处理实验数据以均数±标准差(X±s)表示, 用两样本t检验判断空白对照组与实验组间免疫器官生长指数、吞噬指数和PFC数的差异, 用卡方检验判断空白对照组与实验组间吞噬百分率差异。
2 结果 2.1 小白鼠脾脏重量和生长指数的变化空白对照组脾脏重量缓慢增加, 但差异无显著性(P > 0.05);低剂量钼组脾脏增重明显, 差异显著(P < 0.05);高剂量钼组脾脏重量增加缓慢, 且差异不显著(P > 0.05;表 1)。低剂量钼组生长指数均高于空白对照组, 14 d、21 d时差异显著(P < 0.05;表 1);高剂量钼组生长指数呈下降趋势, 与空白对照组差异均显著(P < 0.01)。
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7d(n=5) | 14d(n=5) | 21d(n=5) | |||||
| 脾脏重量(mg) | 生长指数(mg/g) | 脾脏重量(mg) | 生长指数(mg) | 脾脏重量(mg) | 生长指数(mg) | |||
| 空白对照组 | 142.23±0.25 | 6.26±0.43 | 152.24±0.39 | 7.30±0.14 | 168.72±0.86 | 7.16±0.53 | ||
| 低剂量钼组 | 151.09±0.37 | 6.86±0.43 | 187.24±0.67 | 8.13±0.35* | 257.49±0.68 | 9.834±0.81* | ||
| 高剂量钼组 | 87.76±0.84 | 3.95±0.21* | 96.12±0.32 | 3.27±0.32* | 100.36±0.43 | 2.06±0.50* | ||
| 注:* P <0.05 vs.空白对照组; # P < 0.01 vs.空白对照组 | ||||||||
2.2 吞噬细胞功能检测
巨噬细胞内可见被吞噬的鸡红细胞呈圆形, 边缘整齐, 蓝绿色(图 1)。空白对照组、低剂量钼组、高剂量钼组小白鼠巨噬细胞吞噬百分率分别为(35.59 ± 1.54)%、(64.27 ± 2.61)%、(24.39±1.28)%; 吞噬指数分别为:0.73 ± 0.26、2.15 ± 0.52、0.36 ± 0.19;低剂量钼组小白鼠巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数都明显高于空白对照组(P < 0.01);高剂量钼组小白鼠巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数都明显低于空白对照组(P < 0.05)。
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| 图 1 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能检测 |
2.3 体外抗体形成细胞检测
由于抗体形成细胞所分泌的抗体和绵羊红血球结合形成抗原抗体复合物, 在补体作用下可使红细胞溶解, 于特制的小室内形成肉眼可见的溶血空斑, 一个空斑即代表一个PFC(图 2, 图 3)。空白对照组、低剂量钼组、高剂量钼组小白鼠1×106个脾细胞所含PFC个数分别为360.5 ± 11.8、590.1 ± 19.9、183.1 ± 21.4;低剂量钼组PFC数明显高于正常对照组(P < 0.01);高剂量钼PFC数明显低于正常对照组(P < 0.01)。
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| 图 2 溶血空斑形成示意图 |
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| 图 3 小鼠脾脏体外抗体形成细胞检测 |
3 分析与讨论
钼是动物的必需微量营养元素, 具有重要的生物学功能。适量的钼能减少心血管疾病的发生, 具有抗氧化、抗癌、增强机体免疫力的作用, 但过量的钼则可以引起免疫器官病理损伤, 免疫功能下降[1-3], 其重要原因之一是由于高浓度钼拮抗铜的吸收, 而引发动物机体的继发性铜缺乏[5-6], 铜可参与造血和骨髓蛋白的合成, 促进机体生长并可提高免疫力。脾脏是机体最大的外周免疫器官, 具有滤过血液的作用, 是成熟T、B淋巴细胞定居、产生抗体、发生免疫应答的场所[7]。实验结果表明, 低剂量的钼(20 mg/L)可促进免疫器官迅速增重, 其原因可能是低剂量钼能刺激脾脏的生长发育或使机体免疫器官产生应激反应, 功能亢进, 重量增加; 而高剂量的钼(500 mg/L)可使小白鼠脾脏生长指数下降, 与对照组差异显著; 高剂量的钼使Cu、Fe代谢失衡, 使机体的电子传递、细胞氧化过程受阻, 从而降低了机体的代谢水平, 使淋巴细胞坏死、实质细胞萎缩, 阻碍免疫器官的生长发育, 降低机体免疫功能。PFC的本质是参与特异性体液免疫应答、产生抗体的B淋巴细胞, 其检测结果反映机体的特异性体液免疫功能强弱; 巨噬细胞吞噬功能是机体非特异性免疫的重要组成部分, 其检测结果反映机体的非特异性免疫功能强弱[4]。本研究结果表明, 20 mg/L饮水可增强小白鼠脾脏B淋巴细胞和巨噬细胞功能, 提高机体非特异和特异性免疫功能; 钼含量高于500 mg/L饮水使小白鼠脾脏B淋巴细胞和巨噬细胞功能减弱, 降低机体非特异和特异性免疫功能。
目前国内在钼对机体免疫功能的影响研究还只是处于起步阶段, 影响钼吸收代谢的因素、不同种类动物对钼的最低需要量尚未确定, 现有的实验结果差异也较大。近年来随着钼矿的开采, 环境污染的范围和程度日趋加剧, 中毒现象不断发生, 研究钼对机体免疫功能等方面的影响, 对于探索钼环境控制和钼缺乏的防治研究具有重要意义。
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