多环芳烃主要是以附着于颗粒物质的形式存在于大气中，通过呼吸、饮食、皮肤接触等途径进入人体，不仅有致癌、致突变作用和遗传毒性，而且可以通过胎盘与DNA结合形成加合物，导致胎儿DNA损伤，影响胎儿生长发育。母体孕期暴露于高浓度的多环芳烃与低出生体重、胎儿生长受限、早产、出生缺陷等不良出生结局有关[1-6]。部分致癌性多环芳烃(PAHs)通过胎盘，可以引发胎儿肺、肝脏、淋巴组织和神经系统肿瘤[7-8]。然而其生物学作用机制还有待进一步研究。各种遗传学损伤都会通过基因表达来指导细胞功能/个体表型的表现，因此基因表达是各种遗传损伤和细胞功能/个体表型之间的桥梁。BaP是主要的致癌性多环芳烃之一，本研究将分析宫内BaP暴露对胎儿几个癌症相关基因表达的改变，从而分析其可能的作用机制和潜在的健康影响。
1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂Waters 2960高效液相色谱仪及色谱工作站(美国)、Waters 474荧光检测器(美国)、Supelco固相萃取装置(美国)、3 mL 500 mg C18固相萃取小柱(美国Supelco公司)、QIANGEN Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR仪(德国)。
QIAGEN RNeasy Mini Kit试剂盒(德国)、TaKaRa SYBR Green Realtime PCR Master Mix试剂盒(日本)、BaP标准品(美国Supelco公司)、甲醇(色谱纯，德国Merck公司)等。
1.2 样品的采集及保存2010年3月—4月在太原市某二级甲等综合性医院随机收集20个新生儿的脐带血各10 mL，其中2 mL脐带血冻存于-80℃低温冰箱中，用于RNA的提取。8 mL脐带血当天分离血清，-70℃避光保存，用于血清BaP的检测。
1.3 血清多环芳烃测定用高效液相色谱—荧光检测法测定血清中BaP的含量。1 mL血清经固相萃取浓缩至100 μL甲醇中，采用梯度淋洗法进行检测。荧光检测器Ex = 280 nm，Em = 389 nm，进样量为10 μL，流速为0.8 mL/min，流动相为乙睛:水(0 min: 60% : 40%，20 min: 60% : 40%，35 min: 100% : 0，45min: 60% : 40%)。
1.4 Real-time PCR基因表达检测用QIAGEN RNeasy Mini Kit试剂盒进行总RNA提取。根据GeneBank数据库中各基因的序列信息，使用引物设计软件primer expression 2.0设计RPL27A、NUDT2、E2F1和内参基因hsaGAPDH的PCR引物，引物由上海英骏生物技术有限公司合成(表 1)。
采用SYBR染料法检测基因的相对表达量，所用试剂盒为TaKaRa SYBR Green Realtime PCR Master Mix。
PCR扩增，反应过程及循环条件:预变性(95℃，30 s)，变性(95℃，5 s)，退火(60℃，34 s)，延伸(72℃，30 s)，40个循环。
采用2-⊿⊿Ct法计算mRNA的表达量:
⊿Ct=Ct目的基因-Ct内参基因
⊿⊿Ct=⊿Ct暴露组-⊿Ct对照组
相对表达量= 2(-⊿⊿Ct)
Ct:指荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
1.5 统计分析用Excel建立数据库，用SAS 9.1进行统计分析。
2 结果 2.1 脐带血BaP水平20份脐带血血清BaP平均浓度为0.38 ± 0.31 μg/L。按照血清BaP浓度，将20份样本分成5个不同水平的暴露组，各暴露组的BaP水平见表 2。
2.2 不同暴露组基因表达水平与BaP暴露水平的相关关系
以第1组为对照组，计算其他各暴露组的RPL27A、NUDT2和E2F1的mRNA相对表达量，分析不同暴露组BaP平均水平与各基因相对表达量的相关关系(见图 1-3)。由图 1-3可见，随着BaP暴露水平的增高，RPL27A和NUDT2呈现表达上调的趋势，而E2F1呈现表达下调的趋势(P＜0.0001)。
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| 图 1 不同暴露组BaP平均水平与RPL27A相对表达量的相关关系 |
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| 图 2 不同暴露组BaP平均水平与NUDT2相对表达量的相关关系 |
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| 图 3 不同暴露组BaP平均水平与E2F1相对表达量的相关关系 |
3 讨论
本研究初步探讨了宫内BaP暴露对RPL27A、NUDT2和E2F1 3个癌症相关基因表达的影响。
RPL27A，定位于染色体11p15，该基因编码的蛋白是核糖体60S的构成蛋白之一，属于核糖体蛋白的L15P家族，位于细胞质内。在RPL27A基因第一个内含子的阅读框有翻译起始密码子ATG，该基因亦保存有转录调控因子、Box-A和GABP序列[9]。基因结构决定基因功能，RPL27A具有转录活性，参与真核细胞翻译的起始、延长和终止，可调控细胞周期。有研究报道该基因在肺癌和结肠癌组织出现表达异常[10]。
随BaP暴露水平增加，RPL27A mRNA表达水平增加，说明RPL27A可能是BaP引发肿瘤的作用机制或靶点之一。
NUDT2位于染色体9p13，该基因编码的蛋白属于MutT核苷焦磷酸酶家族的成员之一，是NUDIX水解酶超家族的一个分支[11]。该基因产物参与特定核苷焦磷酸酶的MutT序列的修饰，而MutT酶可通过水解致突变核苷结合底物如8-oxo-dGTP而防止DNA复制错误[12]。NUDT2是候选抑癌基因。NUDT2蛋白可水解二腺苷5’，5’－ p1，p4-四磷酸盐(Ap4A)为AMP和ATP，以维持细胞内Ap4A的动态平衡。Ap4A与许多细胞功能有关，如参与调控细胞增殖、DNA复制和修复、凋亡等。在细胞受到热、氧化或DNA损伤刺激时，细胞内的Ap4A水平会增加[13-14]，从而诱导细胞凋亡。NUDT2是雌激素抑制基因，在乳腺癌细胞中通过HER2 pathway而被诱导表达。其高表达与乳腺癌的不良临床症状有关，可促进乳腺癌细胞增殖，是乳腺癌的预后因子之一[15]。
随BaP暴露水平增加，NUDT2 mRNA表达水平增加，可能是由于BaP引起的DNA损伤诱导了具有DNA损伤修复调控作用的抑癌基因NUDT2的表达，说明NUDT2也可能是BaP引发肿瘤的机制之一。
E2F1基因定位于20q11.2，该基因编码的蛋白属于转录因子E2F家族。E2F家族在细胞周期调控中发挥重要作用，是抑癌基因，也是小DNA肿瘤病毒转化蛋白的靶对象。E2F蛋白包含几个保守结构域，包括DNA结合结构域、与转录因子蛋白(DP)相互作用的二聚体结构域、富含酸性氨基酸的反式激活结构域和肿瘤抑制相关结构域。E2F1可调控细胞增殖，参与p53依赖性和非依赖性凋亡(p53-dependent/independent apoptosis) [16]。E2F1的高表达可以激活ATM \ ATR \ CHK1和CHK2等激酶的活性，促使p53 N端丝氨酸残基磷酸化而被激活，从而诱导DNA损伤修复、细胞周期阻滞或细胞凋亡[17-20]。E2F1也可以直接反式激活p73启动子，而诱导细胞周期阻滞和凋亡[21-22]。E2F1和c-Myc还可通过诱导转录和调控信号转导通路来调控细胞生长和死亡[23]。
然而，E2F1也可以抑制凋亡、促进癌细胞存活而发挥癌基因的作用[24]。有研究发现E2F1、NF-κB和EGR1在前列腺癌中出现过表达(overexpression)，对细胞增殖、存活和转移起重要作用[25-30]。Zheng等[31]的研究表明，E2F1可与NF －κB(nuclear factor-κB)相互作用，诱导Egr1基因的转录表达，而EGR1蛋白增多可以诱导一系列生长因子的生成，包括EGF (epidermal growth factor)、PDGF (platelet-derived growth factor)和IGF-Ⅱ (insulin-like growth factor Ⅱ)等，这些生长因子可激活重要的细胞生存信号通路(survival pathway)-PI3K/AKT信号通路(Phosphoisitide-3-kinase/AKT pathway)，从而促进抵抗药物诱导的前列腺癌细胞的凋亡。
细胞凋亡或凋亡抑制是DNA损伤修复失败后的两种重要的竞争性的结局，细胞凋亡是自主性的细胞清除过程，是为了更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。细胞凋亡抑制是癌症发生的重要机制之一。E2F1做为凋亡调控因子，究竟发挥癌基因还是抑癌基因的作用，可能主要取决于其下游基因的存在/缺失或状态。
在本研究中，随着致癌物质BaP暴露水平的增加，E2F1表达下调，可能会有两种情况，第一种情况，如果E2F1诱导凋亡，发挥抑癌基因的作用，那么，随着宫内BaP暴露水平的增加，E2F1表达下调，说明宫内BaP暴露可使E2F1诱导凋亡的作用减弱，则在一定程度上可能会增加以后患癌的风险; 另一种情况，如果E2F1抑制凋亡，发挥癌基因的作用，那么，随着宫内BaP暴露水平的增加，E2F1表达下调，则可能是由于致癌物BaP引起机体反馈性的损伤修复机制，如非E2F1诱导的p53依赖的损伤修复，由于p53的过度表达，可以反馈性地抑制E2F1的表达，这种损伤修复的反应也说明了宫内BaP暴露可能会给胎儿带来不良影响，E2F1可能是BaP引发不良影响的作用机制或靶点之一。
低剂量、持续的环境污染暴露对健康的影响已越来越引起人们的重视，苯并(a)芘等多环芳烃来源广泛，污染普遍存在，其对人群的健康影响是不容忽视的。本研究仅初步探讨了苯并(a)芘对最敏感人群—生命初期阶段可能的分子水平的影响，为今后进一步深入研究起抛砖引玉的作用。
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