三氯乙烯是轻工业企业中应用较多的职业性毒物之一, 广泛应用于金属脱脂、织物干洗、五金、电子等多个行业, 可经呼吸道、胃肠道和皮肤被人体吸收。进入体内的三氯乙烯主要在肝脏代谢, 代谢产物主要为三氯乙酸和三氯乙醇, 绝大部分在代谢后经肾脏由尿液排出。后者可迅速与葡糖醛酸结合形成葡糖醛酸三氯乙酯, 且三氯乙醇的形成和排出较三氯乙酸要快, 一次接触24 h后或长期较恒定接触后, 尿中三氯乙醇与三氯乙酸排出量之比约为2:1^[1]。

我国《职业接触三氯乙烯的生物限值》(WS /T 111-1999) ^[2]中规定, 工作周末的班末尿中三氯乙酸浓度限值为0.30 mmol /L(50mg /L)。2009年美国ACGIH发布的生物接触指数(BEIs)为工作周末的班末尿中三氯乙酸浓度15 mg /L、血中游离三氯乙醇浓度0.5 mg /L。三氯乙醇由于易挥发损失, 存在游离态和与葡萄糖醛酸的结合态两种形式, 在测定上有一定难度。所以多将三氯乙酸作为三氯乙烯的生物监测指标。目前, 对于三氯乙烯生物监测指标的研究主要针对尿中的三氯乙酸、三氯乙醇以及总三氯化合物^[3]。有文献报道^[4]尿中三氯乙酸和三氯乙醇含量与空气中三氯乙烯的浓度均具有良好的相关性, 但不同个体之间尿中三氯乙酸含量差异性较大, 当环境中三氯乙烯浓度高于50 ppm (即273.7 mg /m³)时, 三氯乙酸与外暴露水平之间的相关性并不显著。另外, 三氯乙酸作为三氯乙烯接触的监测指标特异性不强, 它同时也是四氯乙烯、甲基氯仿在体内的主要代谢产物和监测指标。三氯乙醇代谢量较三氯乙酸更高, 在不同浓度和不同人群的研究中, 尿中三氯乙醇的浓度都与外暴露水平表现出了良好的相关性。因此, 评价三氯乙烯的接触水平时, 单一测定三氯乙酸并不能作为接触和受害程度的准确指标, 其代谢物总量更具有代表性^[4]。这就需要建立合适的尿中三氯乙醇总量的检测方法。

生物样品中三氯乙醇的检测最早使用分光光度法, 但灵敏度和特异性差。近年来多使用气相色谱法、高效液相色谱法、离子色谱法或与质谱联用的方法对其进行测定, 并开发了液液萃取、固相萃取、固相微萃取、蛋白沉淀等预处理手段^[5]。本研究用β-葡萄糖苷醛酸酶将尿中结合态三氯乙醇水解为游离态, 建立了尿中三氯乙醇总量的顶空气相色谱检测方法, 并对职业接触三氯乙烯工人的尿样进行了测定。

1 材料与方法 1.1 仪器和条件

1.1.1

气相色谱仪(6890 N, 美国安捷伦公司), 配电子捕获检测器(ECD, Ni⁶³); 自动顶空进样器(7694E, 美国安捷伦公司); 水浴锅; 20 mL顶空进样瓶。

1.1.2 顶空条件

炉温90℃, 平衡45 min, 进样器的定量环温度100℃, 传输线温度110℃, 进样体积1 mL。

1.1.3 色谱分析条件

色谱柱: HP-FFAP(键合交联聚乙二醇涂层)毛细管柱, (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm, 美国安捷伦公司); 进样口温度200℃, 检测器温度250℃, 初始柱温70℃, 保持2 min, 以20℃ /min升温至140℃保持6 min; 载气流速(N₂)1 mL /min; 分流进样比10: 1。

1.2 试剂

1.2.1

三氯乙醇标准品(美国Sigma-aldrich公司), 纯度＞99.9%; H-3型β-葡萄糖醛酸裂解酶(美国Sigma-aldrich公司), 无水醋酸钠和醋酸均为分析纯, 实验用水为去离子水, 电阻值≥ 18.2 ΜΩ/ cm。

1.2.2 酶溶液的配制

取4.1 g无水醋酸钠, 加去离子水充分混匀后定容至100 mL, 用醋酸调节pH值至4.5 ~ 5.0后即配制成醋酸钠缓冲溶液; 向100 mL的缓冲液中加入初始活度为100 000 U /mL的β-葡萄糖苷醛酸酶原液0.4 mL, 此时该溶液的酶活度为400 U /mL(即0.5 mol /L)。

1.2.3 标准溶液的配置

准确吸取100 μL三氯乙醇标准品于100 mL容量瓶中, 用去离子水定容至刻度, 配置成浓度为1550 μg /mL的三氯乙醇标准应用液。取5只10 mL容量瓶, 分别加入三氯乙醇标准应用液0.01, 0.05, 0.1, 0.5和1.0 mL, 加去离子水定容至刻度, 配制成1.55, 7.75, 15.5, 77.5和155 μg /mL的标准系列。取2 mL标准溶液, 2 mL去离子水及1 mL醋酸钠缓冲液加入顶空瓶, 按1.1中条件测定。

1.3 样品采集

用气密性良好的具塞聚乙烯管收集三氯乙烯接触工人工作1周后下班前1 h的尿样(不少于50 mL), 测定比重合格(1.010 ~ 1.030之间)后, 立即冷藏, 尽快运输至实验室置于-70℃冰箱内冷冻保存。

1.4 样品处理和测定

将尿样从冰箱中取出, 恢复到室温, 摇匀后取2 mL样品移入顶空瓶中, 同时加入2 mL去离子水和1 mLβ-葡萄糖苷醛酸酶溶液, 50℃水浴8 h后, 放入自动顶空进样器, 按1.1中条件进行测定。以保留时间定性, 色谱峰面积定量, 由标准曲线计算得到尿样中三氯乙醇的总浓度。

2 结果 2.1 色谱条件的优化

使用不同程序升温条件对职业接触三氯乙烯工人的尿样进行测定, 最终确定起始温度为70℃保持2 min, 以20℃ /min升温至140℃保持6 min。此条件下, 三氯乙醇与三氯乙酸和其他杂质分离效果好且保留时间较适宜。

2.2 水解条件的选择

2.2.1 水解时间的确定

水解时间是影响酶水解效果的一个重要因素。水解温度为37℃, 水解酶用量1 mL时, 探索不同水解时间对检测结果的影响。结果表明(图 1), 水解时间在2 ~ 24 h范围内时, 水解时间为8 h时三氯乙醇响应值最大。

2.2.2 水解温度的确定

水解时间8 h, 水解酶剂量为1 mL, 探索37℃、50℃和70℃ 3个不同水解温度对检测结果的影响。结果表明, 水解温度为50℃时三氯乙醇响应值最大。

2.2.3 水解酶的用量

水解温度为50℃, 水解8 h条件下, 探索水解酶的用量在1、2和3 mL时检测结果的变化。结果表明, 三氯乙醇响应值在这三个剂量下并无显著区别, 以成本最小为原则, 选择1 mL的用量。

2.3 顶空进样条件的选择

2.3.1 顶空平衡温度

平衡温度由60℃提高至90℃时, 三氯乙醇的响应值不断增大, 因溶剂为水, 顶空瓶内的温度不易超过100℃, 选择90℃为平衡温度, 此时进样器的定量环和传输线温度分别为100℃和110℃。

2.3.2 顶空平衡时间

平衡时间由15 min延长至45 min时, 响应值有所增加, 而再延长至60 min时, 响应值变化不大, 故选择45 min作为样品的平衡时间(图 2)。

2.4 正交试验

在以上实验条件的选择过程中, 每次只能探讨一个实验因素对结果的影响, 而没有考虑到实验过程中多个处理因素和各因素多个水平之间的相互作用。因此引入正交设计方法对实验的各方面参数条件进行优化组合, 以期寻找到最佳的实验条件。根据前期实验结果, 本研究设定了酶的水解时间(A)、水解温度(B)、水解剂量(C)及顶空进样器的平衡时间(D) 4个处理因素, 每个因素选择4个不同的效应水平(表 1)。然后按照正交设计表L₁₆ (4⁵) (4个水平, 4个因素, 16组实验)的安排并完成实验。利用直观分析法和极差分析法对实验结果进行分析。结果表明, 使用1 mLβ-葡萄糖苷醛酸酶溶液在50℃的温度下水浴8 h, 并在顶空进样器内平衡45 min时, 三氯乙醇响应值最大。处理因素对实验结果的影响程度从大到小依次为酶的水解温度, 顶空进样的平衡时间, 水解时间和水解剂量。在此条件下, 职业接触工人尿样中的三氯乙醇能与其他代谢产物物很好的分离(图 3)。

2.5 线性范围及最低检出浓度

根据标准溶液的响应强度, 以信噪比等于3时对应的浓度为最低检出浓度, 则该方法的最低检出浓度为0.03 μg /mL。以三氯乙醇浓度(X)对峰面积(Y)得回归方程及相关系数为Y = 1 442.7 X + 1 391.4, 标准曲线相关系数(r)为0.999 6, 标准曲线在0.03 ~ 155 μg /mL范围内呈良好线性关系。

2.6 方法精密度

选择正常人尿样和不同剂量水平的三氯乙烯接触工人尿样, 在同一天内对每各浓度样品平行测定6次, 根据测定结果计算相对标准偏差RSD作为日内精密度(表 2)。每天对同一浓度样品测定1次, 连续测定6 d, 根据结果计算RSD作为方法的日间精密度(表 3)。实验结果表明, 本方法的批内精密度范围4.1% ~ 7.6%, 批间精密度范围5.2% ~ 10%。

2.7 方法准确度

在同一样品中加入不同浓度的标准溶液, 每个浓度平行测定6个样品, 取平均值计算加标回收率作为该方法的准确度, 由实验结果(表 4)可知, 本方法的加标回收率范围为86.6% ~ 107.9%。

2.8 方法的应用

利用本研究建立的方法对某地区三氯乙烯职业接触者(25人)的尿样及其工作场所的外暴露水平进行了检测, 同时, 采集同一地区非三氯乙烯接触者(对照组, 10人)的尿样, 测定尿中三氯乙醇的含量。当工作场所空气中三氯乙烯浓度在3.3 ~ 316 mg/m³范围时, 接触者尿中三氯乙醇含量为0.66 ~ 628.9 μg /mL。接触组工人尿中三氯乙醇含量与外暴露计量水平具有良好的相关性。对照组尿中三氯乙醇含量范围为0.22 ~ 0.27 μg /mL。对接触组和对照组人群尿中三氯乙醇检测结果进行统计学分析, 两独立样本的单侧检验结果表明, 两组数值具有显著性差异(P＜0.01), 即三氯乙烯接触工人尿中三氯乙醇含量明显高于对照组。

3 结论

本研究建立了尿中三氯乙醇的顶空气相色谱检测法, 与蛋白质沉淀或萃取法提取待测物的方式相比, 顶空进样简便易行, 污染小, 费用低, 不需添加任何萃取试剂, 只需目标化合物遇热具有挥发性即可。与液相色谱法相比, 气相色谱可以缩短分析时间, 并与顶空进样器联用直接测定分离后的气体样品。但顶空法进样每个样品只能取样1次, 无法进行平行测定。

同时, 本研究也探讨了影响顶空气相色谱法检测尿中三氯乙醇实验过程中的各处理因素对测定结果的影响, 利用正交设计对实验预处理方法中酶的水解时间、水解温度、水解剂量及顶空进样器的平衡时间四个处理因素的不同效应水平进行组合优化, 筛选出了最佳的预处理条件。本研究建立的方法灵敏度高, 方法处理过程简便, 取样无损伤, 回收率和精密度均满足生物监测方法的要求, 可用于三氯乙烯接触工人尿样中三氯乙醇的检测。