由于汽车尾气、工业“三废”以及生活垃圾等固体废弃物的大量排放, 致使城市周边环境普遍受到污染, 而蔬菜生产基地通常位于市郊或城乡结合部, 大气中的有机污染物经过雨水的冲洗作用亦最终进入土壤, 再加上温室蔬菜生产中化肥、农药、地膜等化学品的广泛使用, 使得有机污染物污染尤为严重。有研究检测发现, 农田土壤样品中除检出胺类、烷烃类外, 还检测出苯类、醇类、多环芳烃等有机毒物^[1]。因此, 为评价在塑料大棚温室这一特殊种植环境下, 其土壤有机提取物(extractable organic matter, EOM)对人类健康造成危害的可能性及危害程度, 本实验通过慢性EOM灌胃染毒建立动物模型, 利用Morris水迷宫, 研究EOM对于小鼠空间学习记忆能力的影响, 并从神经递质、脂质过氧化等生化指标入手对其机制进行了初步探讨。

1 材料与方法 1.1 土壤样品的采集及有机物的提取

采用梅花形布点法采集蔬菜大棚(6年棚龄, 种植西红柿)土壤样品, 弃杂物, 风干, 研磨, 过50目筛备用。称取土壤样品50.0 g, 用索氏提取器提取有机物, 提取液为1:1丙酮/石油醚混合液, 温度为80℃, 提取8 h。提取液经旋转蒸发仪浓缩干燥后, 用二甲基亚枫(DMSO)定容于10 mL作为原液备用, 相当于5.0 g土壤干重/mL DMSO。染毒时用植物油稀释到指定浓度。

1.2 动物分组、染毒

选择10周龄的昆明种系清洁级雄性小鼠50只, 体重15 ~ 20 g, 随机分为5组:阴性对照组用DMSO和植物油6:4混合液染毒; 阳性对照组为水迷宫试验前腹腔注射东莨菪碱5 mg / kg·bw, 隔日染毒2次; EOM低剂量组、中剂量组和高剂量组, 染毒液分别为0.5 g、1.5 g和3 g土壤干重/mL, 染毒方式为每日灌胃1次, 10 mL液体/ (kg·d), 相当于染毒剂量分别为5 g、15 g和30 g土壤干重/ (kg小鼠体重·d), 连续染毒4周。

1.3 水迷宫试验

末次染毒结束6 h后对小鼠进行水迷宫训练。水迷宫试验历时6 d。

1.3.1 定位导航试验

试验历时5 d, 每天训练4次, 将小鼠从NW, NE, SW, SE四象限的中点向水池放入, 并开始记时录像, 记录小鼠找到平台的时间(逃避潜伏期), 找到后让小鼠在平台上休息15 s。如果120 s内小鼠找不到平台, 时间记录为120 s, 并将小鼠引导至平台, 在平台上休息15 s。计算每天内4次训练逃逸潜伏期的算术平均值做为当天的学习成绩。

1.3.2 空间探索试验

定位导航试验训练完毕第2天, 撤除平台, 记录小鼠2 min内在原平台象限搜索时间占总时间的百分比和在原平台象限搜索距离占总距离的百分比, 并记录小鼠在2 min内跨过平台相应位置的次数。

1.3.3 可视平台试验

将平台上升至液面上2 cm, 每只小鼠试验3次, 分别从不同的3个入水点入水, 记录小鼠逃逸潜伏期、逃逸距离及游泳速度。以排除染毒造模导致小鼠感觉、视觉、知觉及运动功能的差异对空间记忆的影响。

1.4 大脑皮质和海马神经生化指标的测定

行为学实验结束后将小鼠脱颈椎处死, 立即取出全脑, 分离大脑后外1 /4的皮质(含海马和胼胝体)去除髓质, 用冰冷的生理盐水漂洗干净, 按1:9的比例(W: V)加入预冷的生理盐水, 在玻璃匀浆管中充分磨碎, 使组织充分匀浆化, 将制备好的10%匀浆以3000 r /min低温离心机离心15 min, 取上清液分装, 置-20℃冰箱保存备用。

总蛋白含量采用考马斯亮兰法测定。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、丙二醛(malonaldehyde, MDA)含量、一氧化氮合酶(nitrieoxide synthase, NOS)活性、NO含量、乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AChE)活性和Ach含量均采用南京建成生物工程研究所的检测试剂盒检测。

1.5 统计学方法

实验数据均以x ± s表示。采用SPSS 13.0软件进行统计分析。各组间(不含阳性对照组)比较采用方差齐性检验和单因素方差分析。组间两两比较:若方差齐时, 采用SNK检验; 若方差不齐时, 采用Games-Howell检验。P＜0.05表明差异有统计学意义。

2 结果 2.1 Morris水迷宫实验结果

2.1.1 定位导航实验

定位导航试验中, 小鼠寻找平台的潜伏期可以很好地反映小鼠的学习能力。如表 1所示, 随着训练次数的增加, 各染毒组和对照组的逃逸潜伏期逐渐缩短, 说明在训练过程中形成了一定的学习记忆能力, 达到了训练效果。在训练第4、5 d, EOM中、高剂量组小鼠的逃逸时间显著长于对照组(P＜0.05), 提示其训练效果较对照组要差。训练第5 d, 随着剂量的增加, 其小鼠寻找平台的潜伏期越长, 具有明显的剂量效应关系(第4 d: r = 0.89348465, P = 0.1065;第5 d: r = 0.96728066, P = 0.0327)。结果表明, EOM慢性染毒后小鼠空间学习能力明显受到影响。

2.1.2 空间探索实验

空间探索实验通过分析小鼠在平台象限和其它象限游泳时间和距离, 反映了小鼠对实验环境的空间记忆能力。撤除平台后, 各组小鼠在原平台所在象限搜索的跨平台次数、时间和距离百分比如表 2所示。在EOM中、高剂量组和阳性对照组中, 原平台象限搜索的跨平台次数、时间百分比和距离百分比较对照组明显减少, 差异均具有统计学意义(P＜0.05)。结果表明, EOM染毒后小鼠空间记忆能力明显受到影响。

2.1.3 可视平台实验

将平台上升到水面以上, 小鼠入水后发现平台的逃逸潜伏期、逃逸距离和游泳速度在各组间均无统计学差别(P＞0.05)。详细结果如表 3所示。

2.2 大脑皮质和海马神经生化指标的测定

随着EOM暴露剂量的增加, MDA含量增加, SOD活性降低, NOS活性和NO含量逐渐降低, AChE活性增加, ACh含量降低。经方差分析发现, 除SOD活性外, EOM各剂量组大脑皮质和海马中以上各指标皆具有统计学差异(P＜0.01), EOM高剂量与对照组间比较差别皆有显著性意义(P＜0.01)。

3 讨论

NIOSH报道^[2], 40%的有机污染物具有神经毒性, 而神经毒物常在未引起器官和形态损伤时, 就已产生了神经行为学和神经生物学的改变。Morris水迷宫是一种用于小鼠空间学习记忆能力检测的实验装置, 目前已被广泛应用于神经生物学、神经行为学和神经药理学等领域^[3]。本次Morris水迷宫实验选取了定位导航、空间探索和可视平台3个测试指标。定位导航实验主要测试实验动物空间学习记忆能力, 本研究发现, 在训练第4、5 d, EOM中、高剂量组小鼠的逃逸时间显著高于对照组, 提示其训练效果较对照组要差, 并且训练第5 d, EOM染毒剂量与潜伏期具有明显的剂量效应关系, 表明EOM慢性染毒后小鼠空间学习能力明显受到影响。在有机污染物致神经毒性研究中, 夏涛^[4]亦曾研究发现, 水迷宫定位导航实验中, 多溴联苯醚和多氯联苯对大鼠找到平台的潜伏期和路径产生明显的影响, 随着染毒剂量的增加呈现增大的趋势, 与本研究结果基本一致。空间探索实验主要反映仔鼠的参考记忆和空间记忆保持能力。从测试结果看, EOM中、高剂量组小鼠原平台象限搜索的跨平台次数、时间百分比和距离百分比较对照组均明显减少, 表明小鼠的空间记忆能力受到EOM的影响。可视平台实验主要目的为排除动物模型制作过程中导致的小鼠运动和感觉功能的障碍, 增加对小鼠视觉功能的测试^[5], 本研究发现各组小鼠入水后发现平台的逃逸潜伏期、逃逸距离和游泳速度均无统计学差别, 表明本实验所用的染毒剂量尚未造成小鼠产生运动和感觉功能方面的改变。

Kline等^[6]曾研究表明氧化应激与大鼠的空间学习能力损伤有关, 可导致神经退行性病变。MDA即脂质过氧化物的代谢产物, MDA含量可反映机体内脂质过氧化物的程度, 间接地反映出机体细胞受氧自由基攻击的严重程度。研究发现, 随着EOM暴露剂量的增加, MDA含量增加, 并且EOM各剂量组均显著高于溶剂对照组, 我们前期EOM靶器官毒性研究中亦发现脑、肾、肝等MDA含量显著增高。国内学者李鹏^[7]及高红霞^[8]亦分别证实了嘉陵江重庆主城区段水体EOM和污灌土壤中的EOM可诱导机体产生脂质过氧化损伤作用。SOD是生物体内氧自由基清除系统的首要防线, SOD活力的高低间接反映了氧自由基的生成量和机体清除氧自由基的能力^[9]。但是本研究未发现各组大脑皮质和海马中的SOD活性有统计学差异, 我们分析可能是机体抗氧化防御体系包括酶促与非酶促两个系统^[9]。在脑中, SOD防御系统可能居于较次要地位, 亦或与EOM染毒剂量相对较低有关。

NO是中枢神经系统细胞间信使分子, 具有第一信使和神经递质功能, 与突触可塑性及学习记忆关系密切。本研究结果表明EOM染毒组小鼠大脑皮质和海马中NOS活性降低, 内源性NO合成减少。学习和记忆亦与多种中枢神经的功能有关, 如胆碱能神经和谷氨酸能神经等。目前认为与学习记忆关系最密切的是皮质、海马的胆碱能神经, 破坏了ACh系统会引起学习记忆能力下降^[10]。本研究发现, 随着EOM染毒剂量的增加, 小鼠皮质和海马中的AChE活性增加, ACh含量增加, 由此推测, EOM可能通过增加乙酰胆碱酯酶活性, 从而使ACh合成与释放减少, 破坏胆碱能神经功能, 从而引起学习记忆功能降低。与本研究结论相近, 程淑群^[11]亦研究发现较低剂量苯并芘慢性暴露可影响海马神经递质的含量, 如ACh含量降低、氨基酸神经递质降低, 单胺类神经递质增高, 以及NO /NOS减少和诱导海马脂质氧化性损伤等神经生化指标变化。

总之, 土壤中的EOM有可能是通过诱使NO / NOS和ACh含量降低、脂质氧化性损伤等神经生化指标的变化, 影响学习记忆能力, 最终可能导致整体神经行为功能变化。