中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)是一种重要的体外试验材料[1-2]。在CHO细胞应用过程中，当引入增/溶剂来处理难溶待测物时，增/溶剂本身可能对CHO细胞活性产生影响，从而干扰测试结果判定。结合化妆品安全性评价特点，为了解不同增/溶剂的适用性，特对8种常见助/溶剂影响CHO细胞活性的特点进行观察分析。
1 材料与方法 1.1 主要材料和仪器中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(中国协和医科大学细胞库); MEM培养液(Hyclone); 胎牛血清(FCS) (Hyclone); S9(汇智泰康(北京)医药技术有限公司); 胰蛋白酶(Solarbio); 刃天青(Alfa Aesar); 细胞培养箱(Heraeus); 倒置显微镜(Olympus); Varioskan Flash全波长多功能读数仪(Thermo); 丙酮、DMSO、吐温-20、吐温-60、甲醇、95 %乙醇、乙酸乙酯和丙三醇均为国产分析纯。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养用含5% FCS的MEM培养液，于37℃、5% CO2培养箱中培养CHO 48 h。以1 × 105 /mL密度传代接种，3 ~ 4 d传一代。测试前24 h将CHO细胞按3 × 104 /孔密度接种于96孔培养板中，置培养箱中培养。
1.2.2 剂量设定和细胞染毒分别将8种增/溶剂用灭菌生理盐水配制成4.0 % (m / v)储备液后，稀释成2倍比浓度梯度用于测试。S9混合液按《化妆品卫生规范》(2007版) [3]中方法配制。另设生理盐水做为空白对照。试验组和对照组各设4个复孔。3 h染毒按以下程序进行:吸去96板孔中培养液，等体积(100 μL /孔)向板孔中加进设定浓度的受试物，代谢活化组同时加入S9混合液(40 μL /孔)，以不含血清的培养液补足每孔总体积至200 μL，放培养箱中作用3 h; 24 h染毒按以下程序进行:吸去96板孔中培养液，等体积(100 μL /孔)向板孔中加进设定浓度的受试物，以含血清的完全培养液补足每孔总体积至200 μL后放培养箱中作用24 h。上述试验过程结束后，弃去含受试物的培养液，用D-hanks液洗细胞3次，加入完全培养液，继续培养24 h后，进行细胞活性测试。若细胞抑制率(R)结果出现明显集中于过高，如＞70 %或过低，如＜20%，则应重新调整染毒剂量后进行上述测试过程，直至求得的细胞抑制率分散良好。
1.2.3 刃天青法测定细胞活性以终浓度5 μM向上述96孔板中加入刃天青液，置37℃培养箱中孵育4 h。在激发波长530 nm，发射波长590 nm下测定板孔荧光强度。以测得荧光强度(FI)反映细胞活性。
1.2.4 数据处理细胞抑制率由式R(%) = [(FI对照-FI本底)-(FI给药-FI本底)]/ (FI对照-FI本底) × 100 %算得。Logit法计算半数抑制浓度IC50和IC5。
2 结果各增/溶剂在加入和不加入S9混合液，以及3 h和24 h作用时间情况下，对CHO细胞的IC50和IC5结果见表 1和表 2，其中非离子型增溶剂吐温-20的IC50低至小于0.5 mg /mL (24 h处理组小于0.05 mg /mL)。
3 讨论
增/溶剂常用于处理测试中碰到的难溶物[4]，利用CHO细胞进行体外染色体畸变测试的过程中应用增/溶剂，有可能对CHO细胞产生不良影响，而影响测试结果。目前可用于生物实验的增/溶剂种类繁多，CHO细胞实验中如何合理选用增/溶剂却鲜有文献报道[5]。本研究对8种常见增/溶剂影响CHO细胞活性的特点进行了观察分析，为今后测试合理选用增/溶剂提供参考。
根据《化妆品卫生规范》(2007版)中对体外染色体畸变测试的要求，增/溶剂与CHO细胞接触时间在染色体畸变测试中有3 h和24 h两种情况[3]，本研究设计进行了增/溶剂与CHO细胞接触3 h和24 h两种情况染毒测试。结果发现，在加入和不加入S9混合液，以及不同作用时间情况下，各增/溶剂对CHO细胞具有不同的IC50。其中非离子型增溶剂吐温-20的IC50＜0.5 mg /mL ((24 h处理组＜0.05 mg /mL)。说明相同使用条件下，各增/溶剂对CHO细胞活性存在不同程度的影响，提示日常检测工作中有必要进行增/溶剂的合理选择。IC5可被看做对细胞活性影响甚微的化学物界值，在增/溶剂选用中可被当做该增/溶剂的最大引入量。基于此本研究中同时计算了各增/溶剂对CHO细胞的IC5。结果显示，在S9存在条件下，丙酮、DMSO、吐温-20、吐温-60、甲醇、95 %乙醇、乙酸乙酯和丙三醇3 h的IC5分别为9.0、2.0、0.1、0.6、1.0、1.0、0.8和1.4 mg /mL; 无S9存在条件下，上述各增/溶剂3 h和24 h的IC5分别为1.0和0.1、1.1和0.3、0.1和＜0.01、0.1和＜0.01、1.1和0.4、0.5和0.6、0.5和0.3，以及0.5和1.5 mg /mL，提示在3 h (+ S9) 测试条件下，为避免增/溶剂对CHO细胞活性产生明显影响，丙酮、DMSO、吐温-20、吐温-60、甲醇、95%乙醇、乙酸乙酯和丙三醇的最高使用浓度分别不应大于0.9 %、0.2 %、0.01 %、0.06 %、0.1 %、0.1 %、0.08 %和0.14 %，其中DMSO最高使用浓度要比现行《化妆品卫生规范》(2007版)中规定的0.5 %要低。若同时考虑到不加入S9混合物及作用延长至24 h情况，各增/溶剂的实际使用浓度应该更低。综合考虑，在日常利用CHO细胞的检测中，为最大降低增/溶剂对测试结果带来的影响，3 h测试期应以保守的不加入S9混合物情况下求得IC5 :丙酮、DMSO、甲醇、95 %乙醇、乙酸乙酯和丙三醇分别为0.1 %、0.1 %、0.1 %、0.05 %、0.05 %和0.05%作为其最大使用浓度; 24 h测试条件下上述溶剂的最大使用浓度分别为0.01%、0.03 %、0.04 %、0.06 %、0.03 %和0.2 %; 不建议吐温-20和吐温-60作为增溶剂引入CHO细胞相关测试中。
本研究以CHO细胞活性作为增/溶剂能否选用的指标，判定上简单有效。限于时间因素，研究中仅选用8种常见增/溶剂作为观察对象，所提供的资料难免有限。化学物检测实践客观需要更多的增/溶剂资料以供选择使用，相应数据库的建立今后有待进一步加强。
| [1] | Wu MF, Peng FC, Chen YL, et al. Evaluation of genotoxicity of antrodia cinnamomea in the ames test and the in vitro chromosomal aberration test[J]. In Vivo, 2011, 25(3): 419–423. |
| [2] | 周飞, 林海霞, 常艳. CHO细胞体外微核高内涵筛选方法的建立及应用[J]. 癌变·畸变·突变, 2011, 23(1): 31–34, 37. |
| [3] | 中华人民共和国卫生部. 化妆品卫生规范[S]. 北京: 军事医学科学出版社, 2007. |
| [4] | 陈优生, 张健泓. 提高难溶性药物溶解度的研究[J]. 海峡药学, 2008, 20(7): 25–27. |
| [5] | OECD Guideline for testing of chemicals—Guideline 476: In vitro mammalian cell gene mutation test. Adopted 21st July 1997 [EB/OL]. Available: http://www.oecd.org/dataoecd/18/32/1948426.pdf |