1 引言(Introduction)

藻-菌颗粒污泥工艺具有能耗低、CO₂排放量少等优势, 作为一种有潜力的废水处理技术近几年被广泛关注(Muñoz et al., 2005; Su et al., 2011; Zhang et al., 2021).其可基于藻-菌间的互利共生关系, 无需外部曝气, 同时减少二氧化碳排放(Ji et al., 2020a; Guo et al., 2021).据报道, 藻-菌颗粒污泥工艺的污染物去除效果可优于好氧颗粒污泥工艺(Liu et al., 2018; Guo et al., 2021).目前关于藻-菌颗粒污泥处理市政污水的研究主要集中在光照、温度等环境因素(Meng et al., 2019; Ji et al., 2021), 四环素等新型污染物(Wang et al., 2020; Wang et al., 2021), 以及污染物去除机理(Ji et al., 2020b)等, 关于藻-菌颗粒污泥胞外聚合物(EPS)及其表面特性的研究鲜有报道.

胞外聚合物(EPS)是微生物分泌的一类复杂的高分子聚合物, 主要由胞外蛋白(PN)和胞外多糖(PS)等组成(Yan et al., 2015; Xiao et al., 2016).EPS显著影响微生物聚集体的物理化学性质, 特别是表面电荷、疏水性、粘附性、结构和沉降特性(Lin et al., 2014; Xiao et al., 2016).胞外多糖中的阿拉伯糖、岩藻糖、鼠李糖等已被证实可促进微藻类细胞聚集、影响细胞与基质的粘附(Bahat-Samet et al., 2004; Willis et al., 2013).Su等(2020)的研究发现, EPS可通过改变微生物细胞的表面电荷和/或疏水性并形成聚合物机制来促进细胞聚集.此外, EPS基质可为细胞提供一层保护层, 使其免受环境的不利影响(Lin et al., 2014; 樊鹏超等, 2017).

如上所述, EPS可在微生物聚集体的细胞聚集及颗粒特性维持中起到重要作用, 阐明藻-菌颗粒污泥EPS及其表面特性, 有助于进一步认识藻-菌颗粒的特质.本研究拟通过三维荧光(3D-EEM)和傅里叶变换红外光谱(FTIR)等表征方法, 比较不同粒径藻-菌颗粒污泥EPS含量和组成差别及官能团特征, 探讨EPS提取前后藻-菌颗粒表面电荷的变化, 阐明藻-菌颗粒的EPS表面特性及其维持藻-菌颗粒特性的关键物质.本研究可为藻-菌颗粒污泥的进一步工程应用提供理论基础.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 藻-菌颗粒的培养条件

本研究选取的藻-菌颗粒在合成废水中培养而成, 预先将活性污泥培养成好氧颗粒污泥, 再以LED为光源, 光强为200 mmol·m^-2·s^-1, 经过3个月的运行(即曝气培养1个月和静置培养2个月), 得到成熟的藻-菌颗粒污泥, 并用于后续的实验.合成废水主要成分如下：571.5 mg·L^-1 CH₃COONa、114.6 mg·L^-1 NH₄Cl、22.0 mg·L^-1 KH₂PO₄、10.0 mg·L^-1 FeSO₄·7H₂O、20.0 mg·L^-1 NaHCO₃、10.0 mg·L^-1 CaCl₂、50.0 mg·L^-1 MgSO₄·7H₂O和1.0 ml·L^-1微量元素溶液.微量元素溶液包括10 g·L^-1 EDTA、150 mg·L^-1 H₃BO₃、100 mg·L^-1 MnSO₄·H₂O、30 mg·L^-1 CuSO₄·5H₂O、120 mg·L^-1 ZnSO₄·7H₂O、60 mg·L^-1 Na₂MoO₄·2H₂O、180 mg·L^-1 KI和150 mg·L^-1 CoCl₂·6H₂O.初始pH值控制在7左右.

采用筛孔分别为0.36、0.71、1.0、1.25、1.6、2.0 mm的系列筛网对不同粒径的藻-菌颗粒污泥进行分离, 筛选出3段粒径范围大小的颗粒污泥, 其粒径分别为0.36~0.71、1~1.25、1.6~2.0 mm.

2.2 EPS提取与分析

采用一种改进的热提取方法从不同粒径的藻-菌颗粒污泥中提取胞外聚合物(EPS).将不同粒径的藻-菌颗粒污泥依次用0.9%NaCl溶液、0.45%NaCl溶液、去离子水清洗3次, 浓度连续降低的NaCl溶液可以使细胞进行渐进的渗透修饰, 从而防止细胞裂解(Phélippé et al., 2019).将剩余颗粒重新悬浮于30 mL去离子水中, 在80 ℃下加热30 min.将提取液以4500 r·min^-1的速度离心20 min, 上清液通过0.45 μm滤膜过滤, 收集的滤液即提取的藻-菌颗粒污泥的EPS, 用于后续蛋白质(PN)、多糖(PS)和三维荧光(3D-EEM)分析.EPS中PS的含量以葡萄糖为标准品, 用硫酸蒽酮法测定.PN的含量以牛血清白蛋白为标准品, 采用快速Lowry法蛋白质试剂盒测定(Zhang et al., 2016).挥发性悬浮固体浓度(MLVSS)采用标准重量法(水和废水监测分析方法指南编委会, 2002)测定, EPS中PN和PS以每克VSS中的蛋白和多糖计.

2.3 红外光谱和三维荧光光谱

采用溴化钾压片测试方法, 取1~2 mg在-70 ℃冷冻干燥的EPS粉末与200 mg KBr研细均匀, 置于模具中, 在油压机上压成透明薄片, 将样片放入红外光谱仪(Thermo Nicolet 6700)中测试, 波数范围4000~400 cm^-1, 扫描次数为32, 分辨率为4 cm^-1.

取3 mL左右的EPS样品, 使用荧光光度计(F-7100, 日本日立)测定EPS荧光光谱, 用去离子水作为空白样, 并从单个样品光谱中去除.以5 nm为采样间隔, 改变200~400 nm间的激发波长; 以1 nm为增量, 连续扫描200~500 nm发射光谱, 扫描速度为1200 nm·min^-1(He et al., 2018b).采用Origin 2018绘制三维荧光光谱图.

2.4 其他分析方法

分别将提取EPS前后不同粒径的藻-菌颗粒污泥碾碎, 匀浆成污泥悬浮液备用.污泥Zeta电位采用布鲁克海文(Brookhaven)多角度粒度分析仪测定.所有数据通过计算3个平行样品的平均值获得.

通过全自动比表面及孔隙度分析仪(麦克ASAP2460)测定藻-菌颗粒污泥平均孔径和孔容体积.

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 藻-菌颗粒污泥特征

根据藻-菌颗粒污泥大小的不同, 将其分为3组.分组后的藻-菌颗粒污泥具有明显不同的形态特征.不同粒径的藻-菌颗粒污泥表观图如图 1所示, 粒径较大的颗粒形状相对规则, 呈带刺球状, 透光性差, 颜色呈深绿色, 较小的颗粒形状不规则, 颜色较浅.

由表 1可知, 随着粒径的增大, 藻-菌颗粒污泥的平均孔径和孔容体积呈减小的趋势.表明在本研究的颗粒粒径范围内, 粒径越大的藻-菌颗粒污泥, 结构越趋近致密, 与Liu等和He等得到的研究结果相似(Liu et al., 2017; He et al., 2018a).

3.2 藻-菌颗粒污泥EPS组分及含量分析

长期以来, EPS被认为有助于细菌和藻-菌联合体的颗粒化(Huang et al., 2015).图 2显示了PN、PS、PN+PS含量以及PN/PS比值的变化.随着粒径的增加, PN、PS含量均呈增加的趋势, PS的含量由(31.39±1.39) mg·g^-1增加至(55.30±1.25) mg·g^-1, 增加了0.76倍；PN含量由(101.39±0.95) mg·g^-1增加至(150.81±0.16) mg·g^-1, 增加了0.49倍；EPS总量从(132.78±2.34) mg·g^-1增加到(206.11±1.41) mg·g^-1, 而PN/PS从(3.23±0.11)减小到(2.73±0.06).

从结果可知, EPS的含量与粒径大小呈正相关关系, 表明粒径较大的藻-菌颗粒污泥能分泌更多的EPS, EPS含量的增加有利于藻-菌联合体的颗粒化(Huang et al., 2015).PN为藻-菌颗粒污泥EPS中的主要物质, 占EPS含量的70%以上.但随着藻-菌颗粒污泥粒径的增加, PN在EPS中占比呈减少趋势, 由76.4%减小到73.2%, PS含量的增速远大于PN含量的增速.事实上, 粘性和亲水性的PS更有利于细胞聚集和造粒(Hou et al., 2015), 其能够促使生物群体通过桥联作用形成交叉的网状结构(Yan et al., 2015), 从而促进颗粒状结构的形成.

通过三维荧光光谱以表征EPS中的有机物质(图 3).分别在不同粒径的藻-菌颗粒污泥的EPS中观察到4个明显的峰值A(Ex/Em 275/340~350), B (Ex/Em 225/300~320), C (Ex/Em 225/330~345)和D (Ex/Em 275/420~430), 分别代表可溶解性微生物副产物、芳香蛋白酪氨酸类物质、芳香蛋白色氨酸类物质和腐殖酸类物质(Chen et al., 2003；王硕等, 2015).由图 3可知, 随着藻-菌颗粒污泥粒径的增大, 芳香蛋白酪氨酸类物质的含量明显增加, 腐殖酸类物质含量亦呈总体增加趋势, 芳香蛋白色氨酸类物质和可溶解性微生物副产物含量变化不大.此外, 根据发射波长尺度的不同, 峰A、D发生红移, 峰B、C发生蓝移.三维荧光光谱峰值的红移与羰基、羟基、氨基或羧基等官能团的存在有关, 而蓝移意味着芳香性物质、芳环数量和共轭键的丰度减少(Chen et al., 2003).通过三维荧光光谱表征的EPS中蛋白质含量的变化趋势和采用Lowry法测定的蛋白质含量变化趋势一致.芳香蛋白酪氨酸类物质含量的明显增加, 说明其在藻-菌颗粒污泥造粒和促进颗粒絮凝方面可能起到重要作用.如其带来的苯环间的Π-Π堆积作用(李旖瑜等, 2017)在促进藻-菌聚集体造粒方面可能起到重要作用.

通过FTIR进一步检测藻-菌颗粒污泥EPS随粒径增加而发生的变化.如图 4所示, 3种粒径EPS的FTIR峰值和数目相当接近, 表明化学基团的类型是相似的.然而, 对比各个峰的强度表明, 化学基团的相对含量存在差异.3424 cm^-1处的吸收峰, 是由—OH和—NH₂的伸缩振动引起的(Yan et al., 2015), 2933 cm^-1附近出现的不对称吸收峰属于烷烃类有机物和大分子多糖中—CH₂的不对称伸缩振动(李莹等, 2020).1645 cm^-1和1252 cm^-1附近的吸收峰为蛋白质二级结构所特有, 分别为酰胺Ⅰ带中β-折叠片状蛋白质结构的C＝C和C＝O伸缩振动(Hou et al., 2015)和酰胺Ⅲ带中—CN的伸缩振动(Yan et al., 2015).1406 cm^-1处的峰属于与氨基酸相关的—COO中C＝O的对称拉伸(Hou et al., 2015), 1058 cm^-1附近的峰是由于多糖或类多糖物质中的对称和不对称C＝O伸缩振动所致(李莹等, 2020).吸收峰小于1000 cm^-1属于指纹区域, 出现了氨基酸和核酸的特征伸缩振动峰(Yan et al., 2015).

上述表明, 不同粒径的藻-菌颗粒污泥EPS中均存在蛋白质、多糖、醇类、核酸等物质.随着藻-菌颗粒污泥粒径的增大, 3424、2933、1645和1252 cm^-1处的波峰强度逐渐增大, 反映PN特征峰的波峰强度增值明显小于PS特征峰的波峰强度增值, 这与PN/PS的减小相一致.

3.3 藻-菌颗粒表面特性分析

EPS覆盖在微生物细胞的表面, 其组成可以改变颗粒污泥的表面性质, 如疏水性和表面电荷等, 促进细胞之间的聚集和颗粒结构稳定性(Yan et al., 2015).为进一步研究藻-菌颗粒表面特性, 测量并记录了提取EPS前后藻-菌颗粒污泥在pH为8.5的去离子水中的Zeta电位(图 5).结果表明, 在相同条件下, 提取EPS前, 3组藻-菌颗粒污泥的Zeta电位分别为(-20.15±0.59)、(-21.28±0.30)、(-23.18±0.44) mV, 粒径越小的藻-菌颗粒污泥Zeta电位绝对值越小.因此, 颗粒污泥的粒径越小, 颗粒间的排斥力越小, 从而有利于颗粒间的聚集.而提取EPS后, 3组藻-菌颗粒污泥的Zeta电位分别为(-33.00±0.55)、(-32.54±0.19)、(-30.39±0.05) mV, 粒径越小的藻-菌颗粒污泥Zeta电位绝对值越大, 颗粒表面的负电荷量明显上升.提取EPS前后不同粒径的藻-菌颗粒污泥Zeta电位差值分别为(-12.85±0.04)、(-11.26±0.11)、(-7.21±0.39) mV, 粒径越大的藻-菌颗粒污泥在提取EPS后, 表面电荷变化量越小, 表明粒径较大的颗粒可能更能抵御外界环境因素的变化, 维持颗粒性能.

4 结论(Conclusions)

1) 随着藻-菌颗粒污泥粒径的增大, EPS中PN和PS的含量随着颗粒粒径的增加而增加, PN是该藻-菌颗粒污泥EPS中的主要成分, 占其含量的70%以上, 而PN/PS随着粒径的增加而减小, 表明PS在藻-菌聚集体颗粒化过程中可能起到更重要的作用.

2) 由三维荧光和FTIR表征结果, 随着藻-菌颗粒污泥粒径的增大, 芳香蛋白酪氨酸类物质含量增加明显, 说明芳香蛋白酪氨酸类物质可能更有利于维持颗粒结构, 促进颗粒的增长.

3) 由Zeta电位表征结果可知, 粒径较大的颗粒可能更能抵御外界环境因素的变化, 维持颗粒性能.