1 引言(Introduction)

近年来，海上溢油事故频发，我国作为石油消费大国，石油运输大约有90%依靠海运完成，而油轮船体构造相对落后以及片面追求低的运输成本，使得我国海洋环境面临较高的溢油风险(邹葵，2012；张明，2011；Hidetoshi et al.，2012).石油类物质进入海洋后产生的危害是多方面的，包括海洋环境介质、海洋生物以及人类健康(Adriana et al.，2010；Silva et al.，2014；熊善高，2014).关于溢油事故对海洋生物的影响已有较多报道.其中，关于生物群落方面的影响，Zengel等(2016)在墨西哥湾深海溢油事故发生后对路易斯安那州盐沼带的玉黍螺(Littorinidae)的生物密度进行了研究，结果显示在受溢油污染的湿地边缘玉黍螺的密度下降了80%~90%，在湿地内部玉黍螺的密度下降了50%，而岸线的清理工作进一步降低了成年螺类的密度.Herkul等(2012)在波罗的海的一次中型溢油事故发生后，研究了事故海域敏感种(某种片脚类生物)，其丰度均有所下降，而机会种(寡毛纲生物和杂色沙蚕)的丰度上升.关于污染修复方面，Cuny等(2015)研究表明石油污染滩涂修复过程中分散剂的使用并不会显著降低大型底栖动物的物种丰富度和密度.Farid等(2016)研究了石油污染荒漠生物修复技术，指出荒漠土壤修复需要生物添加和生物强化手段，而氮则被认为是生物修复的一个主要限制因素.关于生物毒性方面的影响，相关研究表明石油组分中的有害物质经过生物富集，通过食物链进入人体，对人体健康产生长期影响(Morgane et al.，2011；李艳梅等，2011；沈盎绿等，2011).可以看出，前人的研究多集中于事故发生后的某一次非连续性研究，而关于时间序列上生物体内污染物含量动态变化鲜有报道，本研究以溢油污染潮间带大型底栖动物无齿螳臂相手蟹为对象，分别在采取应急处置及二次修复1 a后，采集沉积物和生物体样品，研究其体内TPH含量分布及动态变化，并开展健康风险评估，以期判断污染区域生态系统修复与恢复措施的有效性，为溢油事故石油烃污染风险评估提供依据，为今后类似事故的处理处置提供参考.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 研究区域

研究区域为河口滩涂湿地，滩地狭长，为淡水或微咸水河口湿地.潮汐属非正规半日浅海潮，一涨一落历时平均为12.4 h，同时具备月大潮和小潮、年枯季和洪季交替的特征.潮间带沉积物以灰色和灰褐色砂-黏土质粉砂为主.潮间带植被主要有芦苇(Phragmites australis)、海三棱藨草(Scirpus mariqueter)、灯芯草(Juncus effusus L)等，底栖动物主要有无齿螳臂相手蟹(Chiromantes dehaani)(韩莎，2012)、中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)、泥螺(Bullacta exarata)、河蚬(Corbicula fluminea)等.此次溢油事故泄漏的油品主要为重质燃油，油品泄漏后进入水体后，形成大面积油膜，受潮汐和风力作用，对研究区域生态环境造成影响.溢油事故发生后，采取了应急处置措施，用机械将污染滩涂沉积物推至中高潮滩集中掩埋区临时填放，避免在潮汐作用下二次污染释放.在一年后采取了二次修复措施，即根据风险评估结果，对重污染集中掩埋区域沉积物进行开挖外运，开挖深度为1 m，然后回填长江口来沙(实验室未检出TPH)，最后在回填沉积物上补种芦苇幼苗.

2.2 样品采集与处理

本研究涉及3次采样过程，第1次在应急处置后采集了集中掩埋区8个样点(1~8号)的沉积物样品；第2次在应急处置1 a后，采集了集中掩埋区核心区4个样点(A~D点)及其垂直于岸线上下潮滩8个样点(距离集中掩埋区20 m)的无齿螳臂相手蟹样品，第3次在二次修复1 a后，采集了集中掩埋区全部8个样点(1~8号，包括核心区A~D点)的无齿螳臂相手蟹样品，采样点位如图 1所示.其中，沉积物样品采集时，每个样点采集4个平行样，使用梅花布点采样法，尽量使采样点均匀分布于污染区域中，各点采集到的沉积物样品充分混匀后，采用四分法收集足量样品装于玻璃瓶中，带回实验室检测.生物体样品采集时，考虑到无齿螳臂相手蟹的活动范围，以集中填放区为中心点，周边20 m²范围内采集无齿螳臂相手蟹样品1 kg左右，当日送回实验室，对剥离出来的内脏和肌肉组织分别进行称重、匀浆，然后放于冷柜中-10 ℃下保存.

2.3 TPH检测分析

沉积物和无齿螳臂相手蟹生物体样品均按《海洋监测规范》(GB17378-2007)(中国国家标准化管理委员会，2007)方法，分别由紫外分光光度法和荧光分光光度法测得TPH含量.其中，沉积物中TPH的检测步骤为：称取(2±0.0001)g沉积物样品于50 mL具塞比色管中，加15.00 mL正己烷，加盖振荡2 min，待分层后，用玻璃注射器吸出正己烷萃取液，注入盛有20.00 mL硫酸钠溶液的60 mL锥形分液漏斗中，用10.00 mL正己烷重复萃取1次，静置分层，将萃取液吸出并入分液漏斗中；于原比色管中加入10.00 mL硫酸钠溶液，将析出的正己烷吸出合并于上述分液漏斗中，振荡分液漏斗2 min，静置分层后，弃去水相(下层).再用20.00 mL硫酸钠溶液重复洗涤2次，弃去水相，用滤纸卷吸干锥形分液漏斗下端管颈内的水分，将萃取液放入25 mL具塞比色管中.然后将溶液盛于1 cm石英测定池中，于波长225 nm处，以标准空白液作参比，测定吸光值.

无齿螳臂相手蟹体内TPH测试步骤为：准确称取(2±0.0001)~(5±0.0001)g生物样于皂化瓶中，加入20 mL氢氧化钠溶液，在室温下避光皂化8~12 h，期间每隔1 h摇动皂化瓶数次，加入20 mL无水乙醇溶液，充分摇匀，4 h后进行萃取，制得样品消化液.将皂化液转入500 mL分液漏斗中，用10 mL二氯甲烷洗涤皂化瓶，洗涤液转入分液漏斗中，加30 mL氯化钠溶液和100 mL水，振荡3 min(注意放气)，静置分层；将有机相收集于旋转蒸发瓶中，与旋转蒸发器链接，在50 ℃水浴中将二氯甲烷萃取液蒸发至0.5 mL，取下旋转蒸发瓶，用氮气将残留二氯甲烷萃取液吹干，准确加入10.0 mL脱芳石油醚溶解残留物；将石油醚溶液转入1 cm石英池内，按选定的仪器参数测定样品制备液和空白样品的相对荧光强度，从工作曲线上查出相应的石油烃的量.

2.4 TPH健康风险评估方法

目前，国际上主要采用EPA推荐的暴露风险评价和致癌风险评价来评估生物体中TPH对人体的健康影响(Pinedo et al.，2013).由于TPH组成成分复杂，主要由烃类物质组成，且仅有少部分多环芳烃的某些组分具有致癌性，因此只表征其非致癌风险即暴露风险指数ERI(Expose risk index)(Pinedo et al.，2014；In Sun et al.，2010；杨晓红等，2013；王进军等，2009；王若师等，2012).

(1)

式中，C_i为生物体中TPH质量分数(mg·kg^-1)，考虑到当地居民对无齿螳臂相手蟹的食用方法(用酒泡后直接食用)，将内脏和肌肉组织均视为食用部位，根据测量时各部位生物量将内脏组织和肌肉组织中TPH浓度换算成生物体中TPH浓度；CW为人均日消费量(g·kg^-1·d^-1)；CW取值由文献调研统计得出，甘居利等(2007)估算得到广东省每人、每天的牡蛎消费量为3 g·kg^-1·d^-1，任敏等(2009)估算得到浙江省象山县每人每天的贝壳类(虾、蟹等)的食用量为8 g·kg^-1·d^-1，王晓华等(2014)估算浙江舟山地区的贝类消费量为8 g·kg^-1·d^-1，考虑到研究区域的特殊性及现场调研当地居民对无齿螳臂相手蟹的饮食习惯，本研究采用的人均日消费量按5 g·kg^-1·d^-1计.RfD为经口摄入参考剂量(mg·kg^-1·d^-1).参考美国EPA风险评估信息系统(IRIS)(US EPA，2014)，TPH经口摄入参考剂量RfD取值为4.3 mg·kg^-1·d^-1.

同时，按可接受暴露风险指数ERI≤1(通常认为当ERI≤1时，受体所承受的非致癌风险在可接受水平内)推算每人、每天无齿螳臂相手蟹的安全消费量CW_lim，可以通过如下公式进行计算.

(2)

3 结果与分析(Results and analysis) 3.1 肌肉与内脏组织中TPH变化特征

4个点位无齿螳臂相手蟹体内TPH含量图 2a所示.从不同组织器官来看，两次采样结果均表明内脏组织中TPH含量要高于肌肉组织，应急处置1 a后内脏组织中TPH含量为79.24~155.41 mg·kg^-1，而肌肉组织中TPH含量为14.39~39.63 mg·kg^-1，内脏组织中TPH含量是肌肉组织的3.9~6.0倍；二次修复1 a后内脏组织中TPH含量为13.9~48.35 mg·kg^-1，而肌肉组织中TPH含量为7.71~20.6 mg·kg^-1，内脏组织中TPH含量是肌肉组织的1.8~2.7倍.

从时间序列上来看，二次修复1 a后无齿螳臂相手蟹体内肌肉与内脏组织中TPH含量与应急处置1 a后相比呈显著下降趋势(p<0.05)，其中肌肉组织中TPH下降了27.44%~48.02%，内脏组织中TPH下降了64.28%~83.81%.虽然二次修复后，生物体内TPH含量有所下降，但仍明显高于研究区附近未受污染区域无齿螳臂相手蟹体内TPH含量(内脏和肌肉组织中TPH含量分别为1.14 mg·kg^-1和0.29 mg·kg^-1)(谭娟等，2014)，这在一定程度上表明生态系统恢复是一个漫长的过程.

无齿螳臂相手蟹内脏与肌肉组织中TPH含量关系如图 2b所示，应急处置1 a后，在集中掩埋区及其上下潮滩区域内，内脏与肌肉组织中TPH含量线性关系为y=3.9116x+19.045(R²=0.8939)，二者呈显著正相关关系(pearson相关系数r=0.923，p＜0.01)；二次修复1 a后内脏与肌肉组织中TPH含量关系为y=2.2261x+2.2245(R²=0.9627)，二者呈显著正相关关系(pearson相关系数r=0.981，p＜0.01).研究结果表明二次修复一方面移除了核心区内受污染影响较大的无齿螳臂相手蟹个体，同时对沉积物中TPH的去除起到了较好的效果，从而阻断了TPH在生物体内的进一步累积过程.而之所以内脏组织中TPH含量比肌肉组织中高，这可能是因为肝脏中富含脂肪，而TPH具有亲脂性，故而肝脏组织中TPH含量高，这与前人的研究结果相一致.吴文婧等(2008)对北京市场中4种淡水鱼不同组织器官中苯并(a)芘含量进行测定分析，结果表明不同鱼种各组织器官中均是肝脏组织中苯并(a)芘含量相对最高.刘宪斌等(2009)对天津高沙岭潮间带泥螺对菲的累积特征进行研究，结果表明，与其他组织相比，泥螺肝脏组织有较强的富集和累积菲的能力.二次修复1 a后内脏组织与肌肉组织中TPH含量的线性回归系数较应急处置1 a后有所下降，一定程度上表明内脏组织中TPH占比有所下降，这也可能与肝脏是生物体最重要的解毒器官有关，随着时间推移，肝脏中部分TPH经过一系列的生物化学过程而转变成其它无毒或低毒物质.

3.2 生物体与沉积物中TPH含量相关性

研究中，将二次修复1 a后各点位内脏组织和肌肉组织中TPH含量与应急处置后对应点位的沉积物中TPH含量进行对比分析(吴健等，2016).由图 3可以看出研究区域中，内脏组织和肌肉组织中的TPH含量与沉积物中TPH含量呈明显线性关系(y=0.001x+4.3831，R²=0.9089；y=0.0004x+1.7744，R²=0.8705).生物体内的TPH含量随着沉积物中TPH含量的升高而增加，表明沉积物中TPH含量在一定程度上直接影响了生物体内TPH的累积，而且这种污染累积影响深远，即便采取修复后若要完全恢复也需一个漫长的过程.

生物体内污染物质的累积是一个复杂的综合过程，其影响因素错综复杂，主要有生物因素(生物种类、个体大小、组织器官和发育阶段等)和非生物因素(栖息环境、季节性变化等)(王子健等，2005；梁丹涛等，2007;李天云等，2008；孙闰霞等，2012).研究表明，溢油事故主要通过影响生物体的栖息环境来影响污染物的累积.Venturini等(2004)使用BIO-ENV程序对底栖生物群落与沉积物污染的相关性进行了研究，结果显示，底栖生物丰度、物种数量和多样性的降低与沉积物中铅、多环芳烃浓度的上升及盐度的降低有关.张晓举等(2014)对渤海湾南部海域生物体内的重金属含量与影响因素研究表明，栖息环境和生物生理特性对海洋生物重金属富集产生直接影响.本研究中，内脏和肌肉组织中TPH含量均与沉积物中TPH含量呈现显著线性关系，表明溢油事故造成的沉积物污染是导致无齿螳臂相手蟹体内TPH累积的重要原因，而通过取食大量的植物、有机碎屑及营养盐类是其体内TPH累积的重要途径之一(Venturini et al.，2004).

3.3 生物体内TPH健康风险动态评估

无齿螳臂相手蟹体内的TPH主要通过皮肤吸入、呼吸作用和食物摄入3种途径进入人体(吴文婧等，2008)，而其经常被当地居民用来食用，其体内的TPH约占90%以上是通过食物摄入进入人体(Binelli et al，2004).因此，本研究中主要评估其经口摄入的健康风险，其他途径的摄入本文不做评估.根据1.4节式(1)和式(2)计算应急处置1 a后和二次修复1 a后无齿螳臂相手蟹体内TPH经口摄入的暴露风险指数和日均安全消费量，结果见表 1.其中应急处置1 a后，各点位生物体中TPH的暴露风险指数为0.077~0.154，A点和B点值明显低于C点和D点，但均小于1，即暴露风险指数处于可接受水平；而二次修复1 a后，各点位生物体中TPH的暴露风险指数为0.015~0.050，较应急处置1 a后有明显下降趋势，同样是C点和D点的风险指数高于A点和B点，各点位生物体中TPH含量未超过危害剂量参考值，同样处于安全水平.按可接受的暴露风险水平进行评估，应急处置1 a后，无齿螳臂相手蟹的安全消费量为32.513~64.725 g·kg^-1·d^-1，而二次修复1 a后安全消费量为100.830~339.599 g·kg^-1·d^-1，较应急处置1 a后有明显的提升.暴露风险指数结果表明，随着时间推移以及采取相应的修复措施后，无齿螳臂相手蟹体内TPH含量明显下降，暴露风险越来越小，修复措施达到效果.

4 结论(Conclusions)

1) 就不同组织器官来讲，内脏中TPH含量均高于肌肉组织，两次采样内脏组织中TPH含量分别是肌肉组织的3.9~6.0倍和1.8~2.7倍，表明肝脏更容易累积污染物.从时间尺度上来看，与应急处置1 a后相比，二次修复1 a后生物体内TPH含量均呈显著下降趋势(p<0.05)，其中内脏组织中TPH下降了64.28%~83.81%，肌肉组织中TPH下降了27.44%~48.02%，表明采取二次修复措施取得一定效果.

2) 在应急处置和二次修复1 a后，无齿螳臂相手蟹内脏中TPH含量与肌肉组织中TPH含量均呈显著正相关关系(r=0.923，p＜0.01；r=0.981，p＜0.01).此外，二次修复1 a后各点位内脏组织和肌肉组织中的TPH含量与应急处置后对应点位沉积物中TPH含量呈明显线性关系(y=0.001x+4.3831，R²=0.9089；y=0.0004x+1.7744，R²=0.8705)，表明沉积物中TPH含量在一定程度上直接影响了生物体内TPH的累积.

3) 健康风险评估结果表明，应急处置1 a后和二次修复1 a后无齿螳臂相手蟹体内的TPH暴露风险指数均处于可接受水平.但是需要指出的是通过对沉积物中TPH含量的健康风险进行评估，结果表明存在风险，因此开展了现场二次修复工作.此外，本研究在评估过程中仅考虑了单一有毒物质对人类健康的危害，未考虑复合毒性作用，而研究证明复合毒性作用尚未明确，因此，健康危害仍然不容忽视，而复合毒性的研究也将成为以后工作的重点.