2016, Vol. 36
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随着全球气候变暖和经济快速发展，由富营养化引发的水体蓝藻水华污染日益严重.蓝藻细胞分泌释放多种生物毒素(Corbel et al.，2014)，其中微囊藻毒素(microcystins，MCs)是一类具有生物活性的环状多肽类毒素(Rinehart et al.，1988)，具有强烈致癌作用(Ueno et al.，1996).由微囊藻毒素所导致的鱼类、鸟类、兽类和人类急性中毒死亡事件多有报道(Ito et al.，2000；Azevedo et al.，2002).研究表明，低剂量微囊藻毒素长期暴露会诱发肝癌、肠癌等肿瘤疾病，同时具有遗传毒性，对人体健康产生深远危害(黄艺和张郅灏，2013；王伟琴等，2010).目前已发现的100多种微囊藻毒素异构体中(Puddick et al.，2014)，MC-LR是检出最普遍、毒性最大、危害最严重的一种微囊藻毒素(Chorus and Bartram，1999).
未经处理的蓝藻水华通过灌溉、堆沤还田、打捞堆放、溢流等途径从水体环境进入农田土壤(Corbel et al.，2015a；Chen et al.，2012).据报道，在蓝藻水华污染频发的太湖、滇池地区周边农田土壤中均检出多种微囊藻毒素，含量在10 μg·kg-1左右(Chen et al.，2012；詹晓静等，2015).由于MCs易被农作物吸收累积，并随食物链对人体健康产生危害(Ibelings and Chorus，2007)，近年来逐渐开展了农田-作物系统中MCs的研究，主要集中于农作物毒害效应和吸收累积方面(Corbel et al.，2015b；Corbel et al.，2014)，缺乏对MCs在土壤中环境行为研究(Chen et al.，2006).本研究以MC-LR为例，通过室内模拟实验研究其在土壤中的降解及其影响因素，以期为土壤中微囊藻毒素生态风险和污染控制提供科学依据.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 实验材料供试土壤：采用不同理化性质的5种土壤作为实验用土，编号1~5.土壤风干后，除去杂物，研碎混匀后，过60目筛备用.测定土壤的理化性质(鲁如坤，2000)，结果见表 1.
| 表 1 供试土壤的理化性质 Table 1 Physical and chemical parameters of the tested soils |
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MC-LR标准品购自台湾Algal Science Inc公司，纯度均＞95%.甲醇和乙腈均为色谱纯，购自Sigma公司.三氟乙酸纯度＞99%，购自阿拉丁试剂公司.其他试剂均为分析纯，购自广州化学试剂厂C试验用水为高纯水.
2.2 实验仪器ABI 4000Q-Trap串联四极杆线性离子阱质谱仪配电喷雾离子源(ESI)(Applied Biosystems公司)；Agilent1100液相色谱(Agilent公司)；Unique-R20超纯水系统(厦门锐思捷科学仪器有限公司)；Sep-pak C18固相萃取柱(6 mL，500 mg，Waters公司)；高速台式离心机(HC-3018R，科大创新股份有限公司)；涡旋混合仪(MS3，德国IKA集团)；超声仪(KQ-800KDE，昆山超声仪器有限公司)；电子天平(BSA224S-CW，苏州赛恩斯仪器有限公司)；恒温振荡培养箱(HZC-250，培英；± 0.5 ℃).
2.3 实验方法 2.3.1 MC-LR在不同土壤中的降解行为称取30 g供试土壤于三角瓶中，加入去离子水调节土壤含水率至30%，塞上棉塞置于25 ℃恒温培养箱中避光培养7 d后，参考实际环境污染状况设置土壤中MC-LR的浓度为20 μg·kg-1，每个处理3个平行，并进行1次重复实验.培养过程中每天称重，适时添加三角瓶内水分含量，保持土壤持水状态(Chai et al.，2013).分别在添加污染物的第1、3、5、7、10、15、30、60 d取样测定土壤中 MCs 的残留量，下同.
2.3.2 初始浓度对MC-LR降解的影响以水稻土(土壤2)为供试土壤，结合环境土壤实测含量、土壤环境中MC-LR的无效应浓度(13.7 μg·kg-1)(詹晓静等，2015)，并考虑极端土壤污染情况，设置5、20和100 μg·kg-1的不同浓度污染土壤，控制土壤含水率为30%、避光、培养温度为25 ℃、不灭菌条件下，研究 MC-LR 在不同初始浓度条件下的降解情况.
2.3.3 环境因素对MCs降解的影响以水稻土(土壤2)为供试土壤，浓度为20 μg·kg-1，避光，设置考察土壤温度(15、25和35 ℃)、含水率(10%、30%和60%)和微生物(灭菌和不灭菌)对MC-LR的降解影响.不同温度处理时，保持土壤含水率为30%，不灭菌；不同含水率处理时，培养温度为25 ℃，不灭菌；不同微生物处理方式时，土壤含水量为30%，培养温度为25 ℃.
2.4 测定方法土样中 MCs 的预处理与分析参考相关方法进行(李彦文等，2013).准确称取2.00 g土壤样品于50 mL离心管中，加入10 mL 0.1 mol·L-1 EDTA-Na4P2O7溶液，静置10 min，涡旋振荡5 min后超声30 min(300 W)，8000 r·min-1离心5 min，收集上清液.重复上述步骤2次，合并上清液，过C18固相萃取小柱富集，收集滤出液，再次过柱，用10 mL高纯水清洗小柱，真空干燥5 min，用5 mL 酸化甲醇洗脱小柱，收集洗脱液.洗脱液氮吹(40 ℃)浓缩至近干，以甲醇定容至1 mL，过0.22 μm 滤膜，置于进样瓶中，于4 ℃冰箱中保存备测.采用Agilent Eclipse Plus C18柱(150 mm×2.1 mm，5 μm)进行色谱分离，进样量为5 μL.质谱分析采用正离子扫描，多离子反应检测(MRM)模式. MC-LR的保留时间为5.53 min.为控制实验质量，保证操作过程准确，每测定7个样品间隔设置空白样、样品平行样、样品加标样.空白样中均未检出MC-LR，平行样标准偏差低于1%，MC-LR的检出限量(LOQ)为0.25 μg·kg-1，样品加标(5 μg·kg-1)回收率分别为64%~86%.
2.5 数据分析考虑到老化过程中土壤吸附等因素对有机污染物生物可利用性的影响，MC-LR在土壤中的降解半衰期采用校正后的一级降解动力学方程(Wang et al.，2006；Shan et al.，2011)进行拟合计算，公式如下：
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(1) |
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(2) |
式中，Ct为t时土壤中 MC-LR 残留浓度(μg·kg-1)； C0为土壤中 MC-LR 的初始浓度(μg·kg-1)； t为培养时间(d)；α为老化系数(d-1)；k为降解速率常数(d-1)；t1/2为降解半衰期(d).
采用Excel 2010、OriginPro 8和SPSS 17.0软件分析数据，显著性分析采用单因素方差分析进行F检验，以皮尔逊相关分析法(Pearson)进行相关性分析.
3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 不同类型土壤中MC-LR的降解行为结果表明MC-LR 在土壤中的降解速率逐渐变缓(图 1)，MC-LR在土壤2、土壤3和土壤4中的降解半衰期分别为2.7、6.3和2.2 d(表 2)，显著低于其在土壤1(11.4 d)和土壤5(11 d)中的降解半衰期，且MC-LR在土壤2、土壤3和土壤4中的60 d降解率接近100%，显著高于土壤1和土壤5中的降解率77.7%和88.5%.参考土壤中农药等有机污染物评价标准(国家农业部农药检定所，2014)，MC-LR(降解半衰期＜ 30 d)属于易降解有机污染物.尽管MC-LR在土壤中易降解，但MCs可通过灌溉、施用藻肥等方式长期持续输入土壤(Corbel et al.，2015b)，同时由于MCs易溶于水，进入土壤后一方面会随淋溶迁移至深层土壤甚至地下水造成生态风险(Mohamed and Al Shebric，2009)，另一方面会通过蒸腾作用被农作物吸收造成食品安全问题(Chen et al.，2012)，因此MCs在土壤中的污染问题不容忽视.
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| 图 1 MC-LR 在不同类型土壤中的降解曲线 Fig. 1 Degradation curve of MC-LR in different soils |
| 表 2 不同类型土壤中MC-LR 的降解动力学方程和模型参数 Table 2 Degradation kinetic equations and parameters of MC-LR in different soils |
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土壤理化性质可影响MC-LR在土壤中降解行为.相关性分析显示MC-LR降解老化系数与pH和阳离子交换量分别呈负相关和正相关关系(表 3)，即土壤pH值越低、阳离子交换量越高，MC-LR在土壤中的老化系数越大，降解越慢.对于土壤pH值而言，其值越低，土壤酸性越强，土壤微生物尤其是藻毒素降解菌活性降低(孔赟等，2011)，导致MC-LR降解变缓.对于阳离子交换量而言，我们发现其与土壤pH值呈显著负相关关系(r= -0.594，p ＜ 0.05)，其值越大，土壤所带负电荷越多，可吸附更多氢离子(H+)，导致土壤pH值降低，酸性增强，从而增加MC-LR的老化能力，抑制其降解.
| 表 3 MC-LR的降解参数与理化性质的相关性 Table 3 Correlations between MC-LR degradation parameter and soil physio-chemical properties |
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设置了MC-LR初始浓度为5、20和100 μg·kg-1的不同处理，研究初始浓度对MC-LR在土壤中降解的影响(图 2).结果表明，在所设定的初始浓度范围，MC-LR的降解半衰期没有显著差异，60 d后土壤中未检出MC-LR(表 4).根据文献报道，MC-LR在土壤环境中无效应浓度为13.7 μg·kg-1(詹晓静等，2015)，该值大于5 μg·kg-1，与20 μg·kg-1浓度处于同一数量级，因此在MC-LR浓度较低时(≤20 μg·kg-1)，其对土壤微生态影响较小，其降解率不随浓度升高而变化.当MC-LR浓度升至100 μg·kg-1，其可影响土壤微生态，但该浓度可能尚未影响到MC-LR降解微生物的降解活性，在此浓度条件下MC-LR的降解速率与较低实验浓度相当.
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| 图 2 不同MC-LR初始浓度对降解的影响 Fig. 2 Effect of initial concentration on the degradation of MC-LR in paddy soil |
| 表 4 不同初始浓度条件下MC-LR的降解动力学方程和模型参数 Table 4 Degradation kinetic equations and parameters of various concentrations of MC-LR in paddy soil |
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结果表明，温度对土壤中MC-LR的降解影响较大(图 3).温度25~35 ℃时，MC-LR降解速率没有显著差异，15 ℃条件下，降解速率显著变慢，这是因为污染物的降解速率与降解菌的最适生长温度相关，越接近最适温度，降解微生物的酶活性越强，降解速率越快.MCs降解菌的最适降解温度在22~30 ℃，随着温度降低，MCs降解酶活性下降(Ho et al.， 2007；Zhang et al.，2015).不同条件下 MC-LR 的降解动力学方程和模型参数如表 5所示.不同土壤含水率下，60 d时MC-LR降解率均达到100%，在含水率为30%和10%时，降解速率较快，半衰期为2.7~3.5 d，没有显著差异，60%含水率时，半衰期为4.1 d，相对较慢，与30%和10%含水率时有显著差异.MCs的降解以好氧降解为主(吕锡武等，1999)，而60%含水率时土壤处于淹水状态，土壤含氧量减少，影响微生物降解作用，降解速率减慢.土壤微生物对MC-LR的降解起着主导作用，避光条件下，灭菌土壤中MC-LR的降解半衰期显著延长，是未灭菌土壤中的2.2倍(孔赟等，2011)，微生物降解是土壤中MC-LR降解的主要途径.
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| 图 3 不同条件对MC-LR的影响(a.温度，b.含水率，c.微生物) Fig. 3 Effects of environment conditions on MC-LR degradation in paddy soil(a.temperature，b.moisture content，c.microorganism) |
| 表 5 不同条件下 MC-LR 的降解动力学方程和模型参数 Table 5 Degradation kinetic equations and parameters of MC-LR under the various conditions in paddy soil |
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1) 参考土壤中农药等有机污染物评价标准，MC-LR(降解半衰期＜ 30 d)属于易降解有机污染物.
2) 土壤理化性质可影响MC-LR在土壤中的降解行为，土壤pH越低、阳离子交换量越大，MC-LR老化系数越大，降解越慢.初始浓度(5、20和100 μg·kg-1)对MC-LR在土壤中的降解影响不明显.
3) 微生物降解是MC-LR在土壤中降解的主要途径.温度、含水率等环境因素对MC-LR降解的影响主要在于改变土壤中降解微生物的活性.
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