1 引言(Introduction)

随着工矿业的发展及农药的滥用，大量外源重金属进入土壤，造成严重的土壤重金属污染，其中，铅是主要的污染物(尹雪等，2014).我国土壤Pb含量最高可达1143 μg·g^-1，最低为0.68 μg·g^-1，平均可达26 μg·g^-1(洪春来等，2010)，铅污染现状非常严重.土壤中的Pb污染不仅会降低农作物的质量和产量，而且还能通过食物链或直接通过人的口部进入体内，影响神经、造血、消化、泌尿、生殖和发育、心血管、内分泌、免疫、骨骼等各类系统和器官，对人类健康构成威胁(崔岩山等，2010).因此，修复与防治土壤中的重金属Pb污染刻不容缓.

目前，理论上和技术上可行的重金属污染土壤修复技术主要有物理修复、化学修复、微生物修复和植物修复等(王显海等，2006).其中，植物修复技术因具有修复成本较低、治理效果永久、应用面积大、环境美学价值高、有利于改善生态环境等优势受到更多的关注(周启星等，2004).植物修复技术主要包括植物稳定、植物提取和植物挥发3种方法.其中，植物提取是目前研究较多的方法，是指利用植物将重金属从根部运转到地上部，富集在生物量大、积累能力强的植物的茎和叶之中，然后将植物地上部收获并集中处理，以降低土壤中的重金属含量(Salt et al.，1998).Pb在土壤中的存在形态常以可交换态、碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态、有机物硫化物结合态和残渣态等5种形式存在(Tessier et al.，1979)，Pb很容易被土壤胶体吸附，植物可获得性很低.目前仅发现了5种Pb超积累植物，包括圆叶遏蓝菜(Thlaspi.Rotundifoliumk)、十字花科植物Biscutella laevigata、石竹科植物Minuartia vema、Brassica pekinensis和东南景天(Sedum alfredii Hance)等.但这些植物中大多生物量小，且生长缓慢，极大地限制了它们在修复Pb污染土壤方面的应用(Xiong et al.，1997；叶海波等，2003).

螯合剂能够增加土壤中重金属Pb溶解度，促进重金属Pb从根部向地上部运转，形成复杂的稳定的螯合物，因此向土壤中施加螯合剂有助于植物对Pb的吸收(王红新等，2011).近年来，人们对多种多羧基氨基酸的修复效果进行了研究，如EDTA、EGTA、HEDTA、EDDS、DTPA、NTA等，结果表明，这些人工螯合剂可以有效增加土壤中重金属的溶解性，提高植物对土壤中重金属的提取效率(李玉红等，2002；Shen et al.，2002).但由于螯合剂与金属的作用，土壤水溶态金属大量增加，容易发生淋洗作用，同时，大多数人工螯合剂本身不会自动降解，会抑制植物生长，破坏土壤结构和微生物群落(Epelde et al.，2008).到目前为止，在这些多羧基氨基酸类螯合剂中，EDTA是应用最为广泛，同时也是效果较好的一种螯合剂，添加EDTA能够明显促进土壤中重金属尤其是Pb的溶解以及在植物地上部分的积累(Shen et al.，2002；Huang et al.，1997).但EDTA及其复合物在土壤中持续时间长、生物毒性大(张玉秀等，2009).

β-环糊精(简称β-CD)及其衍生物具有独特的分子空腔结构，腔内侧具有疏水性，外腔呈亲水性(郑建斌等，2005).正是由于其“内疏水，外亲水”的结构使得与其接触的污染物之间形成一种主-客体包合物，且Pb可以与脱质子化的环糊精形成多核和单核的复合物(梅征等，2012；Norkus et al.，2009).β-环糊精在水中比较容易结晶，溶解度比较低，在25 ℃(室温)水中溶解度为1.85%(李效红等，2010).Zhou等(2007)研究表明，由于β-环糊精单元的疏水空腔结构，其可以用于吸附环境污染中的重金属离子；Ehsana等(2007)报道了β-环糊精与EDTA联合作用可以去除土壤中的镉、铬、铜、铅和锌等多种重金属离子；Sharma等(2010)也提出β-环糊精可以吸附水相中的Pb，是吸附重金属离子良好的材料.由于β-环糊精本身溶解度小，为了增强使用效果，常把它的某些基团进行修饰，得到水溶性较大的环糊精衍生物(谢凝子等，2009).2，6-二甲基-β-环糊精(2，6-Demethyl-β-Cyclodextrin，简称2，6-DM-β-CD，或DM-β-CD或DIMEB)是β-环糊精的一种衍生物，有非常高的水溶解度，室温下水中溶解度达到0.55 g·mL^-1.预测其对重金属治理的效果会更好，而目前关于2，6-二甲基的研究甚少，主要在促进百日咳杆菌的产生、尼索地平对映体的手性分离、影响OS双重荧光光谱等方面(杨芬等，2008；李士敏等，2010).

在筛选螯合剂强化植物提取时，应对那些叶部位置生物量较大的植物给予更多的关注(王开爽等，2014).葎草(Humulus scandens(Lour.)Merr.)为桑科葎草属植物，生物量大，并且能够忍受不良土体和气候状况.近年来，人们对葎草的研究主要集中在其化学成分、药用成分、遗传育种等生理生化方面，同时也偶见葎草在水分、增温胁迫下具有性别差异的文献(Koelling et al.，2012；刘金平等，2013).但将葎草用作重金属污染土壤的修复尚未见报道.

本研究通过盆栽试验，揭示2，6-二甲基-β-环糊精强化葎草提取Pb的作用和机理，研究EDTA和2，6-二甲基-β-环糊精螯合强化效果的差异，旨在为Pb污染土壤修复提供一种新型螯合剂，并为有效开展重金属污染植物修复提供科学依据.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 土壤采集和基本理化性质

土壤采自山西襄汾农业生态园.采集后，放于空气中自然晾干，然后过2 mm和0.154 mm的土壤筛并测定pH值、速效P、速效K和全氮(鲍士旦等，2000)(表 1).土壤水溶态Pb含量采用原子吸收法测定.取过2 mm土壤筛的土壤1 g，加15 mL硝酸和10 mL高氯酸消煮48 h，直到消解液温度达到190 ℃以上，将消解液过滤然后取上清溶液，在原子吸收仪火焰模式下检测(German Jena novAA 400).取过0.154 mm土壤筛的土壤5 g放入离心管中，加入25 mL超纯水，在200 r·min^-1的转速下旋转16 h，然后过滤取上清溶液，在原子吸收仪火焰模式下检测水溶态Pb(German Jena novAA400).

2.2 植物培养

葎草种子于2013年9月采自中国汾河沿岸.2014年2月，将种子撒播于萌发盘中，盖上一层塑料薄膜以保持土壤水分，然后放于光照培养箱内，条件为：12 h白天，12 h黑夜，温度25 ℃/18 ℃(白天/黑夜)，相对湿度60%.当种子萌发后，长到大约2 cm高时，移植至塑料小盆内(直径8 cm，高8 cm)，每盆一株小苗，每天浇一次霍格兰营养液15 mL，在温室大棚内培养2周，直至株高10~15 cm；最后幼苗被移植至Pb污染土壤中，每盆(直径12 cm，盆高12 cm)装烘干的污染土壤0.5 kg，硝酸铅污染剂量分别为0、600和1200 mg·kg^-1(以Pb计).

2.3 土壤染毒

土壤放于清洁塑料布上，用喷壶喷洒硝酸铅溶液，一边喷洒一边轻轻翻动，直至混合均匀，土壤中硝酸铅含量为600 mg·kg^-1和1200 mg·kg^-1(分别记作Pb600和Pb1200)，将土壤放于较大的瓷盘内，每天翻动两次，持续3周，以保证土壤污染程度均匀.

2.4 盆栽试验

螯合剂种类：①无螯合剂(CK)；②EDTA；③2，6-二甲基-β-环糊精；所有药品均购买于天津精细化工品有限公司，药品纯度99.5%.

螯合剂剂量：硝酸铅含量为600 mg·kg^-1时，EDTA和2，6-二甲基-β-环糊精浓度分别为 0.9和1.8 mmol·L^-1，而硝酸铅含量为1200 mg·kg^-1时，EDTA和2，6-二甲基-β-环糊精浓度分别为1.8和3.6 mmol·L^-1.

盆栽试验步骤：每个塑料盆(直径12 cm，盆高12 cm)装烘干的土壤0.5 kg，土壤Pb含量分别为0、600和1200 mg·kg^-1，接着植物被移植并培养在盆中.植物生长7 d后，将相应浓度的EDTA和2，6-二甲基-β-环糊精溶液一次性施加在土壤表面，1周后，收获植物.植物放于温室内培养，使用自然的光照和温度，每种处理3个重复.每个花盆地下放置一个100 mL的托盘，将渗漏的溶液倒回各自花盆中，以防止交叉污染.

2.5 植物收获和处理

植物培养15 d后收割，用流动的水冲洗、去除根部泥土，再用超纯水冲洗3遍，之后植物被分成根、茎、叶3部分，分别放于烘箱内，75 ℃烘48 h，最后研磨.取植物样品0.5 g，用15 mL硝酸和10 mL高氯酸消煮48 h，然后在原子吸收仪火焰模式下检测(German Jena novAA400).每个样品3个重复.

2.6 转移率

转移率(TF)表示植物体内重金属从根部向地上部的转移，计算公式为：

式中，CL表示植物茎、叶部的重金属含量，CR表示根部的重金属含量.

2.7 数据处理

使用SPSS18.0进行数据处理，用Duncan法进行差异显著性检验.所有的数据至少是3个重复处理数据的平均值，数据的显著性是p＜0.05.

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 EDTA和2，6-二甲基-β-环糊精对土壤水溶态Pb含量的影响

当土壤中硝酸铅含量为600 mg·kg^-1时，EDTA、2，6-二甲基-β-环糊精处理的植物水溶态Pb含量分别是对照(CK)的1.50、1.42倍；而当硝酸铅含量为1200 mg·kg^-1时，EDTA和2，6-二甲基-β-环糊精处理的植物水溶态Pb含量分别是CK的1.51、1.38倍.两种螯合剂处理与对照均存在显著性差异(p＜0.05)，但EDTA和2，6-二甲基-β-环糊精两种螯合剂处理之间不存在显著差异(p>0.05)，说明二者对Pb离子均有显著的增溶作用(图 1).

EDTA对Pb离子的増溶效果较前人的研究结果偏低，原因可能与土壤的pH值、螯合剂处理浓度有关(Saifullah et al.，2010).本研究供试土壤pH值为8.03，而土壤pH值是影响土壤重金属活性的最重要因素之一，一般可溶性Pb在酸性土壤中含量较高.随着土壤pH值的升高，大部分微量元素通常会发生吸附作用或形成络合物，土壤对重金属的吸附量增加，会影响有效态Pb含量(韩少华等，2011).另外，土壤的pH值会影响土壤胶体的荷电.一般认为，在酸性条件下土壤胶体带正电，在碱性条件下带负电，pH值的改变会影响土壤胶体的电荷密度，导致其对金属离子的吸附能力的变化(任理想，2008).研究表明，随着EDTA浓度的增加，土壤中Pb可溶态重金属的含量占总重金属含量的比例呈线性提高，本研究结果偏低可能还与试验处理中螯合剂浓度偏低有关.此外，还有研究表明，EDTA/Pb的摩尔比在1.5~2.5时，EDTA对土壤中Pb的溶解度最大，而本研究中螯合剂与Pb的摩尔比分别为0.5和1，这也是造成结果偏低的原因之一(Zhou et al.，2007).

金属螯合物的稳定性越高，螯合剂增溶的效果越好(李玉红等，2002).Pb-EDTA复合物稳定常数较高(logK=17.9)，因此，EDTA提高Pb的溶解能力高于其他螯合剂(Wu et al.，2004).而Pb-β-环糊精这种复杂的螯合物的稳定常数为logK=15.9±0.3，因此，2，6-二甲基-β-环糊精对Pb离子的溶解能力也较高(Norkus et al.，2009).而EDTA和2，6-二甲基-β-环糊精增溶Pb的能力没有显著差别的原因推测可能和EDTA与土壤中多数阳离子(如Cd、Cu、Zn等)的结合能力高于2，6-二甲基-β-环糊精有关，由于金属阳离子的竞争作用导致EDTA对Pb的溶解性降低(Do et al.，2006).2，6-二甲基-β-环糊精在室温下水中溶解度为0.55 g·mL^-1，显著高于EDTA(0.108 g·mL^-1)，但EDTA属于人工多羧基氨基酸，对Pb的螯合能力强，螯合作用持续效果好，提取效果明显(张玉秀等，2009).而2，6-二甲基-β-环糊精属于能溶于水的生物可降解材料，降解速度非常快，这是二者对Pb的增溶效果没有显著差别的另一原因.

3.2 EDTA和2，6-二甲基-β-环糊精对葎草生物量的影响

当土壤中硝酸铅含量为600 mg·kg^-1时，EDTA、2，6-二甲基-β-环糊精对葎草根、茎、叶3部分的干重影响与CK均没有差异，说明在600 mg·kg^-1的情况下，EDTA和2，6-二甲基-β-环糊精对葎草没有明显的毒害作用.但当硝酸铅含量为1200 mg·kg^-1时，EDTA对葎草的生长有轻微抑制作用，在葎草生长过程中，观察到葎草叶片有些发黄、卷曲和萎蔫，但整个培育过程中叶片没有凋落，茎部没有受害状况，葎草的根部颜色变深，看上去有点灰黑色.不施加硝酸铅时，CK和2，6-二甲基-β-环糊精影响下的葎草生物量显著大于EDTA.

当硝酸铅含量为1200 mg·kg^-1，螯合剂浓度为3.6 mmol·L^-1时，葎草整株生物量依次为2，6-二甲基-β-环糊精＞CK＞EDTA，且EDTA与2，6-二甲基-β-环糊精、CK均有差异(图 2)，说明EDTA抑制了葎草的生长，这与前人研究结果相一致(王静雯等，2013；李剑敏等，2007；朱宇林等，2012；王红新等，2011).葎草受毒害的原因一方面可能是高浓度Pb离子在EDTA活化下有效性增强，土壤中Pb离子过多，会使植物叶绿体内蛋白质合成受到破坏，导致叶绿体分解，葎草叶部出现发黄、萎蔫；另一方面也可能是高浓度EDTA有些不能与Pb络合，游离态EDTA比螯合态Pb-EDTA更具有生物毒性(王静雯等，2013；Xiong et al.，1997；Vassil et al.，1998；陈亚华等，2005).2，6-二甲基-β-环糊精影响下的葎草生长正常的原因可能是2，6-二甲基-β-环糊精作为一种无毒无害材料，因其“内疏水，外亲水”的活性仲羧基团使得与其接触的重金属Pb离子之间形成一种主-客体包合物，降低了Pb离子的毒性.

3.3 EDTA和2，6-二甲基-β-环糊精对葎草Pb含量的影响

由图 3a可知，与对照相比，当土壤中硝酸铅含量为600 mg·kg^-1，EDTA和2，6-二甲基-β-环糊精浓度为0.9~1.8 mmol·L^-1时，葎草根部Pb含量分别是对照的1.06~1.74倍、2.94~3.40倍.而在两种螯合剂同样浓度情况下，葎草茎部Pb含量分别是对照的7.37~8.93倍、2.10~3.01倍.同样，叶部Pb含量分别是对照的10.71~15.28倍、2.61~3.61倍.

由图 3b可知，和对照相比，当硝酸铅含量为1200 mg·kg^-1，EDTA和2，6-二甲基-β-环糊精浓度为1.8~3.6 mmol·L^-1时，葎草根部Pb含量分别是对照的2.26~3.62倍、3.44~3.85倍.而在两种螯合剂同样剂量情况下，茎部Pb含量分别是对照的8.79~11.18倍、3.13~6.54倍.同样，叶部Pb含量分别是对照的22.23~24.48倍、5.18~6.11倍.

螯合剂浓度和葎草根、茎、叶部Pb离子的含量呈正相关.土壤污染浓度与土壤中水溶态Pb含量亦具有正相关性，葎草吸收Pb离子的能力也随之增加.600 mg·kg^-1 Pb处理中螯合剂浓度是土壤Pb浓度的1倍(1.8 mmol·L^-1)时葎草根、茎、叶各部Pb含量高于螯合剂浓度是0.5倍(0.9 mmol·L^-1)时的Pb含量，1200 mg·kg^-1时也一样.研究表明，土壤溶液中较高的Pb与螯合剂的比值有利于植物吸收和累积更多的Pb，因为在螯合剂浓度一定时，较高的土壤全量Pb能使更多的Pb与螯合剂络合生成Pb-螯合物，被植物吸收(Epstein et al.，1999).

当不施加螯合剂时，无论硝酸铅含量是600 mg·kg^-1还是1200 mg·kg^-1，葎草体内Pb含量大小顺序为根＞茎＞叶.这可能源于：在细胞外壁，Pb被固定在细胞壁的离子交换位置上，主要以Pb的碳酸盐形式存在，Pb不仅与土壤之间有较强的共价键，也与植物组织形成较强的共价键(Huang et al.，1997).因为木质部细胞壁具有较强的阳离子交换量，那么金属离子的向上运动就会被严重的阻碍(Salt et al.，1998).施加螯合剂之后，不仅促进了葎草根部吸收更多的Pb，而且促进了Pb向植物地上部转移.2，6-二甲基-β-环糊精、EDTA促进了Pb从土壤表面的解吸作用的发生，增加了土壤溶液中的Pb离子浓度，进一步通过木质部，Pb离子由根部向地上部转移(Huang et al.，1997).实际上，2，6-二甲基-β-环糊精和EDTA有效提高了污染土壤中Pb的生物可获得性，并且络合形成Pb-2，6-二甲基-β-环糊精、Pb-EDTA.因此，Pb能够被快速吸收和轻松转移(Vassil et al.，1998).

本研究中EDTA促进植物吸收累积Pb的效果低于其他研究者(陈亚华等，2005；王红新等，2011；祁由菊等，2008；杨明琰等，2014).Saifullah等(2010)认为不同的研究结果可能源于土壤类型、螯合剂的浓度、施加螯合剂的时间和植物种类.Evangelou等(2007)也认为EDTA促进植物吸收累积重金属的效果取决于所研究的植物种类和重金属种类.

3.4 EDTA和2，6-二甲基-β-环糊精对葎草体内Pb转移率的影响

当土壤中硝酸铅含量为600 mg·kg^-1时，EDTA的转移率为1.209，2，6-二甲基-β-环糊精的转移率为0.153，CK的转移率为0.163，且EDTA和2，6-二甲基-β-环糊精、CK均存在显著性差异，2，6-二甲基-β-环糊精和CK之间不存在显著差异(表 2).当硝酸铅含量为1200 mg·kg^-1时，EDTA的转移率为1.023，2，6-二甲基-β-环糊精的转移率为0.294，CK的转移率为0.216，EDTA和2，6-二甲基-β-环糊精、CK均存在显著性差异，2，6-二甲基-β-环糊精和CK之间的差异不明显.说明螯合剂EDTA能很好地促进植物根部Pb离子向植物地上部的转移，而螯合剂2，6-二甲基-β-环糊精对植物体内Pb离子转移率的影响非常小.

当不施加螯合剂时，葎草的富集系数为0.26~0.33，而非富集型植物的富集系数一般低于0.04(叶海波等，2003).因此，葎草对Pb具有一定的耐性，虽未达到超积累的定义，但吸收Pb的效果远好于其他普通植物，具有富集Pb的能力.施加2，6-二甲基-β-环糊精和EDTA后，葎草对Pb的富集系数均显著高于对照CK，说明两种螯合剂处理均可显著提高葎草对Pb的富集能力.

金属的生物可获得性和金属从植物根部向地上部的转移是植物修复成功与否的两个主要的影响因素(Carlos et al.，2001).通常，当转移率大于1时，该种植物适合于用作植物提取修复的参考植物，如果转移率小于1，那么更适合用于植物稳定修复的参考植物(Fitz et al.，2002).EDTA对葎草体内Pb的转移率大于1(表 2)，这与前人的研究结果相一致(王红新等，2011；祁由菊等，2008；李剑敏等，2007；朱宇林等，2012).说明EDTA有助于铅从植物地下部分向地上部分转运，表明葎草可用于螯合辅助植物提取方式的污染土壤修复.这可能与EDTA破坏根系控制离子跨膜运输的生理机制有关，Pb-EDTA螯合体可能通过根系内皮层和凯氏带的裂缝处而吸收，并通过木质部运输，在蒸腾流的驱动下积累于地上部(Vassil et al.，1998；Bell et al.，2003朱宇林等，2012).研究认为，2，6-二甲基-β-环糊精促进葎草体内Pb转移的机理与EDTA一致，而2，6-二甲基-β-环糊精对葎草体内Pb的转移率较低，原因可能与其本身易降解有关.

4 结论(Conclusions)

1)2，6-二甲基-β-环糊精能够显著提高葎草吸收和积累Pb含量，并且对其生长无显著抑制作用.与EDTA相比，2，6-二甲基-β-环糊精螯合强化下葎草的Pb转移率较低，然而由于葎草具有庞大的生物量，且对Pb具有一定的耐性，吸收Pb的效果优于其他普通植物.此外，考虑到EDTA对环境的负面影响，高度可生物降解的无毒的2，6-二甲基-β-环糊精可以作为土壤污染植物修复的一种参考螯合剂.葎草也能够用于螯合剂强化修复土壤Pb污染.

2)2，6-二甲基-β-环糊精能够明显増溶土壤中的Pb，提高土壤溶液中Pb含量，形成Pb-2，6-二甲基-β-环糊精络合物.由于2，6-二甲基-β-环糊精具有“内疏水，外亲水”的特殊结构，推测Pb可能会以Pb-2，6-二甲基-β-环糊精螯合物的形式通过葎草的质外体通道进入木质部，并通过蒸腾流的驱动转运至葎草地上部，积累在叶片中.