1 引言(Introduction)

酒精是重要的工业原料，已被广泛应用于生物、化工、食品等各个领域.全球当前又在积极发展燃料酒精，采用燃料酒精代替石油作为车用燃料(Krylova et al.，2008；方治国等，2011).然而，酒精生产会伴随产生大量的高浓度有机废水，研究发现，每生产1 t酒精，要排放13~16 t废水，废水中污染物成分有残糖、蛋白质、纤维素和盐分等，具有高化学需氧量(COD)、高生化需氧量(BOD)的特点(吴建华，2013).厌氧消化是治理酒精生产废水的主要技术，它既可以高效降解废水中的有机物，降低废水的COD和BOD，又可以生产可再生能源-甲烷.此外，该技术还具有占地面积小、运行费用低和污泥产率低等优势(Fuess et al.，2015;王柯，2014).

厌氧消化是利用厌氧微生物在无氧条件下把有机物转化为甲烷、二氧化碳和少量细胞等，根据运行温度，可分为高温厌氧消化((55±2)℃)和中温厌氧消化((35±2)℃)两类(王柯，2014).厌氧消化的高效、稳定运行依赖于厌氧活性污泥(以下简称“污泥”)的微生物菌群，微生物菌群的种类和分布又主要取决于处理废水的类别和性质.因此，治理不同废水的污泥微生物菌群研究受到了学者们的关注，尤其是高通量测序技术的应用，它对分析污泥微生物菌群的种类和相对丰度，研究工艺参数对种类和相对丰度的影响，考察污泥中微生物的功能，丰富微生物菌群的基础理论等方面有着重要意义(Ghasimi et al.，2015; Hao et al.，2015; Ma et al.，2015).高通量测序技术的种类多样，其中，Illumina MiSeq高通量测序具有操作简单、准确率高等优点(焦晶凯等，2014)，已成功应用于污泥(Hao et al.，2015; Ma et al.，2015)、食品(焦晶凯等，2014)、土壤(Sun et al.，2014)、矿山水(Keshri et al.，2015)、海洋水(Yang et al.，2015)等样本的微生物菌群分析.

我国是酒精生产大国，河南天冠集团是我国酒精定点生产企业，年产酒精98万t，采用二级厌氧消化技术治理酒精废水，日产沼气50万m³.二级厌氧消化包括高温厌氧消化((55±2)℃)和中温厌氧消化((35±2)℃)两个工序，在高温厌氧消化工序中，反应器总体积16万m³，水力停留时间8 d，废水的COD由(35000±2000)mg·L^-1降低至(4000±200)mg·L^-1，BOD由(20000±1000)mg·L^-1降低至(1400±140)mg·L^-1.在中温厌氧消化工序中，反应器总体积4万m³，水力停留时间2.5 d，废水的COD由(3500±200)mg·L^-1降低至(2000±150)mg·L^-1，BOD由(1200±120)mg·L^-1降低至(650±50)mg·L^-1.本实验依托天冠集团的生产规模和技术平台，首次采用Illumina MiSeq高通量测序研究酒精废水治理中污泥(高温厌氧和中温厌氧)的微生物菌群，在属(genus)水平分析污泥中细菌和古菌的种类和相对丰度，探讨不同菌属的功能，以期为阐释厌氧消化技术治理酒精废水的生物机制及该技术的升级改良提供参考.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 样品采集

厌氧活性污泥取样于河南天冠集团.在厌氧反应器稳定运行的条件下，高温厌氧活性污泥分别取样于16个高温厌氧反应器后混合，中温厌氧活性污泥分别取样于10个中温厌氧反应器后混合，样品采集后保存于0 ℃冰盒中并快速移至-80 ℃冰箱中长期保存.

2.2 实验方法 2.2.1 DNA提取

厌氧活性污泥中微生物的DNA按照OMEGA试剂盒说明书的方法和步骤进行提取.

2.2.2 PCR扩增及测序

扩增16S rDNA的V3~V4区域，细菌的PCR引物是Miseq测序平台的通用引物是341F: 5′-CCTACACGACGCTCTTCCGATCTN(barcode)CCTACGGGNGGCWGCAG-3′，805R: 5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACT ACHVGGGTATCTAATCC-3′(Yang et al.，2015).古菌的PCR引物是349F: 5′-CCCTACACGACGC TCTTCCGATCTN(barcode)GYGCASCAGKCG MGAA W-3′，806R:5′-GACTGGAGTTCCTTGGCA CCCGAG AATTCCAGGACTACVSGGGTATCTAAT-3′(Teske et al.，2008).为了确定测序的样品来源，PCR引物中标签序列的插入位置标记为barcode.引物中barcode前面的序列是接头序列，用于识别测序位置，barcode后面的序列是引物序列.通过两轮PCR扩增并完成接头序列的连接，PCR产物在Illumina Miseq高通量测序仪(美国，Illumina公司)上进行测序.第一轮PCR扩增，50 μL反应体系为：10×PCR buffer 5 μL，0.1 mmol·L^-1 dNTPs，10 ng DNA，0.5 μmol·L^-1 PCR primer F，0.5 μmol·L^-1 Primer R，0.05 U Plantium Taq.PCR扩增条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，5个循环；94 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，20个循环；72 ℃延伸5 min.第一轮PCR产物进行第二轮扩增，扩增反应体系中DNA为20 ng，其他与第一轮扩增一致，PCR扩增条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，5个循环；72 ℃延伸5 min.第二轮PCR产物进行琼脂糖电泳，利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对DNA进行回收.利用Qubit2.0 DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量，依托生工生物工程(上海)股份有限公司进行Illumina MiSeq高通量测序.

2.3 数据分析

测序获取原始序列，将双末端序列融合为一个方向的序列并进行质量控制，步骤如下：(1) 序列融合，采用Flash软件(版本1.2.3)融合双末端序列，通过各样品的barcode使数据回归样品，并对各样品序列做质量控制(QC).(2) QC分为4个步骤：①采用Prinseq(版本V0.20.4)软件对序列阅读框的3′端进行质控，截掉Q值低于20的数据，提高后续序列融合比率；②通过Flash软件融合双末端序列，使其形成一条序列；③采用Prinseq软件去除各样品的引物序列、低于200 bp的序列、低复杂度序列和低质量序列；④去除非靶区域序列及嵌合体.首先采用软件Mothur(版本1.30.1)的Pre.cluster模块校正测序错误，校正过程当中允许的最大错配为1/150.其次，采用软件Mothur(版本1.30.1)内的Uchime功能模块，以Silva数据库中的序列作为模板，去除嵌合体及非靶区域序列.

3 结果与讨论(Results and discussion)

测定序列经质量控制后，根据差异水平在0.03(即相似度97%)的水平上聚类得到操作分类单元(OTU).实验获得高温厌氧活性污泥中细菌和古菌的有效序列数量分别为20523和33190，聚类得到OTU数目分别为1729和122，中温厌氧活性污泥中细菌和古菌的序列数量分别为11766和13803，聚类得到OTU数目分别为1701和156.在序列聚类分析的基础上，实验在属(genus)水平上对厌氧活性污泥的细菌和古菌进行分类，统计它们的相对丰度.由于污泥中细菌和古菌的种类繁多，根据相对丰度将污泥中细菌分为优势细菌(相对丰度≥1.0%)和稀有细菌(相对丰度＜1.0%)，古菌分为优势古菌(相对丰度≥1.0%)和稀有古菌(相对丰度＜1.0%)，且将稀有细菌和稀有古菌分别归类于其他.

3.1 高温厌氧活性污泥的优势细菌

高温厌氧活性污泥的优势细菌有10个，包括有Coprothermobacter、Longilinea、Thermodesulfovibrio和Levilinea等，它们的相对丰度如图 1所示.参考已有研究报道分析它们的功能，结果如表 1所示.由表 1可以归纳出高温厌氧活性污泥中优势细菌的主要功能包括4个方面，分别是分解蛋白质、代谢多种碳水化合物生成有机酸、乙酸氧化、硫酸盐还原.此外，在细菌的测序分析中发现了古菌Methanosaeta，它是生态环境中甲烷的主要生产者.细菌和古菌虽然不是同一个域，但它们的16S rDNA基因序列有较高的同源性(刘驰等，2015)，PCR扩增细菌16S rDNA基因的过程中，通用引物可能结合到古菌Methanosaeta的16S rDNA基因并将其扩增.古菌域中只有Methanosaeta出现在细菌的测序分析中，表明高温厌氧活性污泥中Methanosaeta的相对丰度高，这与下文关于高温厌氧活性污泥中优势古菌的分析结果一致.

3.2 中温厌氧活性污泥的优势细菌

中温厌氧活性污泥中优势细菌有21个，包括有Acinetobacter、Succinibibrio、Meniscus和Longilinea等， 它们的相对丰度如图 2所示.比较图 1和图 2可以看出，中温厌氧活性污泥中优势细菌的种类多而相对丰度小.中温厌氧活性污泥中优势细菌的功能如表 2所示，由表 2可以归纳出它们的主要功能包括3个方面，分别是代谢多种碳水化合物生成有机酸、脂肪酸和有机酸氧化、分解结构顽固化合物，如纤维素、酚类化合物、腐胺等.

3.3 厌氧活性污泥的优势古菌

高温厌氧活性污泥和中温厌氧活性污泥的优势古菌及其相对丰度如图 3所示.可以看出，污泥的古菌种类较少，主要是产甲烷古菌，它们是一类能够以乙酸、H₂/CO₂、甲基化合物等为原料生成甲烷的原核微生物(傅霖等，2009).高温厌氧活性污泥中主要产甲烷古菌是Methanosaeta、Methanobacterium和Methanothermbacter，它们的相对丰度分别为57.72%、28.35%和9.90%.中温厌氧活性污泥中主要产甲烷古菌是Methanobacterium、Methanosarcina、Methanosaeta和Methanosphaera，它们的相对丰度分别为33.21%、23.70%、16.63%和11.77%.实验进一步归纳比较厌氧活性污泥中优势古菌的分布、分类单元(目)和主要代谢底物，结果如表 3所示.可以看出，中温厌氧活性污泥的优势古菌种类多于高温厌氧活性污泥的优势古菌种类，且高温厌氧活性污泥和中温厌氧活性污泥有相同的产甲烷古菌，它们分别是Methanosaeta、Methanosarcina、Methanobacterium和Methanosphaera.产甲烷古菌可分为5个目(傅霖等，2009)，分别为甲烷杆菌目、甲烷球菌目、甲烷八叠球菌目、甲烷火菌目和甲烷微菌目，而污泥中产甲烷古菌主要分布于2个目，分别是甲烷八叠球菌目和甲烷杆菌目.

3.4 厌氧消化技术治理酒精生产废水

酒精生产废水的污染物成分有残糖、蛋白质、纤维素和盐分等，厌氧消化技术可以高效降解废水中的有机物，降低废水的COD和BOD，还可以生产甲烷，具有环境效益和经济效益.厌氧消化涉及到众多微生物，各微生物通过直接或间接的营养关系，组成了复杂的互营共生的微生物菌群，消化过程通常分为4个阶段(张庆华，2012)：①水解阶段，细菌将复杂的有机物分解为简单的可溶性物质，如蛋白质被分解为短肽、氨基酸等；②产酸发酵阶段，细菌将可溶性物质等转化为有机酸、脂肪酸和醇类等，产物主要有甲酸、乙酸、乳酸、乙醇、H₂和CO₂等；③产乙酸阶段，是指将产酸发酵阶段中二碳以上机酸、脂肪酸和醇类转化为乙酸、H₂和CO₂的过程；④产甲烷阶段，产甲烷菌以乙酸、H₂和CO₂为底物生产甲烷，其它甲基化合物如甲酸、甲醇等也可以被转化为甲烷.

根据研究结果(表 1~3)，Illumina MiSeq高通量测序分析得到厌氧活性污泥中细菌的主要功能是分解蛋白质，代谢碳水化合物生成有机酸，降解结构顽固化合物，氧化有机酸和脂肪酸生成H₂和CO₂等.厌氧活性污泥中古菌主要是产甲烷古菌，它们能够利用乙酸、H₂和CO₂等底物生成甲烷.污泥中细菌和古菌的代谢功能与酒精生产废水的污染物成分有良好的对应关系，表明Illumina MiSeq高通量测序有效，充分地展示了酒精废水治理中厌氧活性污泥的微生物菌群.此外，在厌氧活性污泥的菌群分析中，发现了硫酸盐还原菌Thermogymnomonas(相对丰度5.67%)、Thermodesulfovibrio(相对丰度4.87%)和Thermodesulfobium(相对丰度1.17%).这是由于酒精生产的淀粉质原料(木薯、玉米等)经过蒸煮糖化得到糖化醪，醪液需利用浓硫酸调节至pH 4.0~5.0范围后用于发酵生产酒精，导致酒精生产废水含有一定量的硫酸盐.厌氧活性污泥在治理酒精废水过程中长期驯化，使得硫酸盐还原菌成为优势菌.酒精企业多采用二级厌氧消化技术治理生产废水，有高温厌氧消化和中温厌氧消化两个工序.两个工序的作用都是降解有机物生产甲烷，但特点不同.高温厌氧消化的有机负荷高，微生物代谢速率快，但一些结构顽固的化合物未被有效降解，高温厌氧消化的出水COD较高.在高温厌氧消化后继续进行中温厌氧消化，进一步转化分解有机物，降低出水COD.实验分析发现，高温厌氧活性污泥和中温厌氧活性污泥中多种优势细菌(Longilinea、Bellilinea和Levilinea)和优势古菌(Methanosaeta、Methanosarcina、Methanobacterium和Methanosphaera)是相同的，但污泥的细菌差异程度高于古菌差异程度，中温厌氧活性污泥中优势细菌的种类多，相对丰度小，且有多种能够代谢结构顽固化合物(Clostridium III、Serratia和Anaerovorax)的细菌.可以看出，在厌氧消化技术治理酒精废水的过程中，高温厌氧消化和中温厌氧消化的相同作用使得污泥中有部分相同的细菌和古菌，它们的不同特点主要取决于污泥中细菌的种类和相对丰度.

4 结论(Conclusions)

实验基于Illumina MiSeq高通量测序研究酒精废水治理中厌氧活性污泥的微生物菌群.结果发现，高温厌氧活性污泥(TAS)中优势细菌有Coprothermobacter、Longilinea、Levilinea等，它们的主要功能是分解蛋白质、代谢碳水化合物生成有机酸、乙酸氧化、硫酸盐还原.中温厌氧活性污泥(MAS)中优势细菌有Acinetobacter、Succinibibrio、Meniscus等，它们的主要功能是代谢碳水化合物生成有机酸、脂肪酸和有机酸氧化、代谢结构顽固化合物.TAS和MAS的古菌主要是产甲烷古菌，分布于甲烷八叠球菌目和甲烷杆菌目.TAS中产甲烷古菌主要有Methanosaeta(相对丰度57.72%)、Methanobacterium(相对丰度28.35%)和Methanothermbacter(相对丰度9.90%).MAS中产甲烷古菌主要有Methanobacterium(相对丰度33.21%)、Methanosarcina(相对丰度23.70%)、Methanosaeta(丰度16.63%)和Methanosphaera(相对丰度11.77%).高通量测序充分展示了酒精废水治理中厌氧活性污泥的微生物菌群，可为阐释厌氧消化技术的生物机制和升级改良该技术提供参考.