1 引言(Introduction)

现代工业的快速发展导致土壤重金属污染现象日益严重.目前, 我国土壤总重金属超标率达16.1%(环境保护部, 2015), 每年受重金属污染的粮食(如“镉米”、“砷米”等)达1000多万t, 造成直接经济损失达200余亿元(龚继明, 2014).重金属通过食物链进入人体后, 会对人体造成不可恢复的伤害(Peralta et al., 2009), 因此, 亟需切实可行的土壤重金属修复技术.植物修复作为一种土壤重金属污染修复方法, 因具有成本低、易操作等优点而备受研究人员青睐(Mcgrath et al., 1998; Neunhäuserer et al., 2001; Ozyigit et al., 2015).速生乔木如某些柳属、杨属植物因其生物量大、生长迅速、积累能力也相对较强, 能较快地提取土壤中的重金属, 从而成为新的研究热点(李松等, 2013；Liu et al., 2013).

速生树种竹柳(Salix sp.)又名美国竹柳, 为杨柳科(Saliaceae)柳属(Salix)乔木(王子成, 2008).竹柳具有生长快、抗性强、材质好、杆形饱满、尖削度小等优点(张健等, 2009), 近年来在我国的种植面积迅速扩大.截止2013年, 我国竹柳种苗培育基地达100 hm², 竹柳成片林超过1300 hm².前期研究中发现, 竹柳可作为潜在的植物修复材料(胡国涛等, 2015), 但对重金属生理响应的研究仍处于空白阶段, 使得竹柳在重金属污染修复中的开发和应用还缺乏理论基础.

重金属胁迫下, 会导致植物叶片叶绿素降低, 体内渗透调节系统发生紊乱, 从而使植物生长受到抑制(Zhang et al., 2011).本研究通过盆栽试验观测竹柳三号及五号在重金属复合污染条件下的光合色素、渗透调节物质、保护酶系统及膜脂过氧化等指标的变化, 旨在揭示竹柳重金属胁迫与各指标之间的关系, 了解竹柳对重金属的耐性机制, 为竹柳作为重金属污染土壤植物修复材料提供生理生态方面的理论依据与数据参考.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 材料准备 2.1.1 植物材料

供试植物为竹柳三号、竹柳五号, 由浙江绿鑫晨农业开发有限公司提供.作为竹柳的两个不同品系, 两者均具有生长快、材质好等优点, 其中, 竹柳三号有较高的耐盐性(朱继军等, 2012), 与竹柳三号相比, 竹柳五号树皮厚, 抗寒能力较强.

挑选粗细均匀直径为1 cm的一年生竹柳枝条, 剪成16 cm长的插条作为营养枝, 用去离子水清洗干净后备用.

2.1.2 供试土壤

供试土壤共两种, 分别为采自浙江省富阳市用于农业种植的水稻土(土壤Ⅰ)及该区域内某炼铜厂附近受重金属复合污染的水稻土(土壤Ⅱ), 取样深度均为0~20 cm.土壤在自然条件下风干, 去除肉眼可见的植物根、枯落物等, 研磨, 过4 mm不锈钢筛, 备用.供试土壤基本理化性质见表 1.前期水培试验结果表明(胡国涛等, 2015), 竹柳在1.12 mg·L^-1 Cd处理中生长不受抑制, 因此, 本试验以土壤Ⅰ作为对照.

2.2 试验布置

试验在浙江农林大学智能温室内进行(30°19′N, 119°35′E), 自然光照, 环境温度为25~33 ℃.试验共设4个处理, 每个处理5次重复.在两种供试土壤中分别加入0.15 g·kg^-1 N、0.08 g·kg^-1 P和0.1 g·kg^-1 K, 混匀后装盆, 每盆3 kg干土.加入去离子水, 维持田间持水量的70%, 在温室中培养7 d后, 每盆中插入一支竹柳营养枝.日常管理主要是浇水、松土、防治病虫害, 保证植物正常生长.生长65 d后, 从每株苗木的固定部位(顶端第6片叶子开始, 从上往下依次取样)采集竹柳成熟叶片样品, 进行测定.

2.3 测定方法

硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量(郑炳松, 2011)；磺基水杨酸提取茚三酮显色法测定叶片游离脯氨酸(Proline)含量(李合生, 2000)；蒽酮比色法测定叶片可溶性糖(Soluble Sugar, SS)含量(李合生, 2000)；考马斯亮蓝法测定叶片可溶性蛋白(Soluble Proteins, SP)含量(郑炳松, 2011)；氮蓝四唑(NBT)光还原法测定叶片超氧化歧化酶(SOD)活性(郑炳松, 2011)；愈创木酚法测定叶片过氧化物酶(POD)活性(郑炳松, 2011)；丙酮乙醇混合液浸提法测定叶绿素含量(张宪政, 1986).

2.4 数据分析

数据结果用Excel 2010计算, 用SPSS 19.0进行单因素方差分析(Analysis of Variance, ANOVA).

3 结果(Results) 3.1 重金属胁迫对竹柳叶片叶绿素含量及生物量的影响

在重金属污染土壤中生长65 d, 竹柳三号、五号叶片都出现了黄化现象.从表 2可以看出, 与对照处理相比, 竹柳三号和五号在重金属复合污染土壤中生长后, 其叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)和类胡萝卜素(Car)含量均显著降低(p < 0.05).其中, 竹柳三号叶片中3种色素的含量分别降低77%、72%和39%, 而竹柳五号的降低量分别为79%、79%和42%.此外, 在对照土壤(土壤Ⅰ)中, 竹柳三号叶片中叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)含量显著高于竹柳五号(p < 0.05).竹柳的叶绿素a/b值维持在2.50~2.95(平均值)之间, 重金属复合污染土壤(土壤Ⅱ)中竹柳三号叶片的叶绿素a/b下降显著.重金属污染土壤中, 竹柳三号叶片生长受抑制, 生物量减少56.7%；而竹柳五号叶片生物量无显著性变化.

3.2 重金属胁迫对竹柳叶片渗透调节物质含量的影响

游离的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白是植物体内3种重要的渗透调节物质.表 3显示了分别在土壤Ⅰ和土壤Ⅱ中生长的竹柳叶片中3种渗透调节物质的含量.竹柳三号叶片中游离的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量受重金属胁迫影响较大, 可溶性糖和可溶性蛋白含量分别降低34%和5%, 而脯氨酸含量增加208%；而竹柳五号叶片中可溶性糖含量下降37.5%, 脯氨酸含量增加363%.对照土壤(土壤Ⅰ)中, 竹柳五号叶片中可溶性糖和可溶性蛋白含量均显著高于竹柳三号(p < 0.05), 分别是其1.15和1.26倍, 而两种竹柳叶片中脯氨酸含量无显著差异.重金属胁迫下, 竹柳五号叶片中脯氨酸渗透量、可溶性蛋白渗透量分别是竹柳三号的1.21倍和1.28倍, 两处理间差异显著(p < 0.05), 而两种竹柳叶片中可溶性糖含量无显著差异(p>0.05).

3.3 重金属胁迫对竹柳叶片保护酶的影响

过氧化物酶、超氧化歧化酶广泛存在于植物的各个组织器官中, 可以清除植物体内H₂O₂, 保护植物体免受H₂O₂的毒害(宋道军等, 1998).多种重金属胁迫下, 竹柳三号过氧化物酶分泌量显著升高(p < 0.05), 是其在对照处理中的1.6倍.随着重金属胁迫的加剧, 竹柳三号、五号叶片中超氧化歧化酶活性显著(p < 0.05)增强, 多种重金属胁迫下超氧化歧化酶含量分别是66.77 U·g^-1和163.53 U·g^-1, 增加幅度分别为36%和31%.土壤Ⅰ和土壤Ⅱ中, 竹柳三号超氧化歧化酶活性分别是竹柳五号的2.55和2.45倍(表 4).

3.4 重金属胁迫对竹柳叶片丙二醛含量的影响

丙二醛是膜脂过氧化物的最终分解产物, 是常用的膜脂过氧化物指标, 其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度(王爱国等, 1986).竹柳三号和五号分别在土壤Ⅰ和土壤Ⅱ中生长65 d, 其叶片中丙二醛含量无显著性差异(p>0.05), 丙二醛含量(平均值)维持在6.81~7.93 μmol·g^-1(表 5).

4 分析与讨论(Analysis and discussion)

叶绿素是植物进行光合作用的主要色素, 其含量的高低能够反映光合作用水平的强弱(范爱君等, 2006).金属胁迫会导致植物叶片的光合色素叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量及叶绿素a /叶绿素b的变化, 进而引起叶片光合功能的改变.竹柳三号和五号在污染土壤中生长时, 叶片均有黄化现象, 3种色素含量均有不同程度的下降(表 2), 可能是重金属镉影响叶绿素合成并引发叶绿素内部结构混乱(李春烨等, 2013；宇克莉等, 2010), 或是过量的铜、锌的存在导致了植物叶片色素结构被破坏(衣艳君等, 2008；Helfrich et al., 2014), 从而使叶绿素含量下降.重金属复合污染土壤中, 竹柳三号叶片的叶绿素a/b值及生物量显著降低但竹柳五号却能维持不变, 说明重金属使竹柳三号叶绿素结构发生破坏, 而竹柳五号对重金属耐性较竹柳三号好.

植物受到重金属胁迫时, 通过生成渗透调节物质来维持正常细胞代谢环境, 以免受重金属危害(郭晓音等, 2009；Dhir et al., 2012; Batool et al., 2014).可溶性糖作为植物碳代谢的物质之一, 与植物抗性具有密切的相关性(董伊晨等, 2009).本试验中, 两种竹柳在对照处理中生长时, 可溶性糖含量均处于较高水平且竹柳五号高于竹柳三号(表 3), 说明正常情况下竹柳可依靠碳水化合物生成来协调细胞源流库关系, 维持细胞膨压从而适应逆境.竹柳在高镉、高锌胁迫下, 可溶性糖含量急剧降低, 这与蒋和平等(2011)研究条浒苔和缘管浒苔在镉胁迫下可溶性糖的变化趋势相同, 其原因可能是重金属镉、锌破坏了植物代谢结构, 使可溶性糖合成受阻(丁海东等, 2006).此外, 植物体内积累游离的脯氨酸能维持细胞渗透压、清除活性氧、保护蛋白质及保护细胞膜(Williamson et al, 1994; Fukuoka et al., 2009; 徐卫红等, 2006), 其含量与重金属耐性有极大相关性(Singh et al., 2010).从表 3可知, 重金属胁迫下, 竹柳三号、五号脯氨酸增加量分别为208%和363%.可溶性蛋白含量是植物体内酶系统稳定的标志(Chakraborty et al., 2012).重金属胁迫下, 竹柳三号叶片中可溶性蛋白含量显著下降, 说明重金属能破坏其内蛋白质的合成, 而竹柳五号则保持不变, 王华等(2008)研究锰超积累植物时也有类似发现.由此可见, 与竹柳三号相比, 竹柳五号对重金属耐性较强.

重金属元素镉、铜、锌含量过高时, 会导致植物体内活性氧自由基水平急剧上升, 活性氧自由基能够破坏细胞膜的完整性, 从而使膜的选择透性丧失, 细胞内含物外渗, 使植物代谢紊乱, 氧自由基生成量超出植物体内清除酶清除能力时, 就会使植物生长发育受到影响, 严重时会导致植物死亡(周希琴等, 2003；Marcu et al., 2014; Zhang et al., 2010).重金属胁迫状态下, 植物体内保护酶活性提高, 有助于清除氧自由基对植物的毒害, 是适应不利环境下重要的耐性机制(张凤琴等, 2008；Reddy et al., 2005).本试验中, 两种竹柳在多种重金属胁迫下, 其叶片超氧化歧化酶活性显著提高且增加幅度相当(表 4), 由此可见, 两种竹柳在重金属胁迫下抵御氧自由基损害的能力基本相当.多种重金属复合污染下, 竹柳三号过氧化物酶活性是其在对照条件下的1.6倍, 这可能是重金属胁迫下竹柳体内产生的过氧化物增加诱导的结果.竹柳三号在多种重金属复合污染下, 超氧化歧化酶、过氧化物酶变化趋势相同, 说明在重金属胁迫下其体内能产生一个较强的抗氧化酶系统, 保护植株细胞免受伤害.

重金属诱导下植物细胞可发生膜脂过氧化, 从而使细胞膜受到伤害、细胞膜稳定性下降, 进而影响到植物细胞的代谢功能(Tsuzuki et al., 2004).本研究中, 用丙二醛生成量来衡量植物膜脂化程度.两种竹柳在重金属污染及对照土壤中, 其丙二醛产生量相当, 各处理之间没有显著性差异.刘俊祥等(2011)采用水培法研究结缕草对重金属镉的生理响应, 也有类似发现.可能原因是持续不断的重金属胁迫可诱导植物叶片, 使其内抗氧化酶清除O₂^-·及修复氧伤害能力提升(谌金吾, 2013; Mishra et al., 2013), 从而能维持丙二醛处于稳定水平.

5 结论(Conclusions)

重金属胁迫下, 竹柳叶片的7个生理指标均受到不同程度的影响.其中, 竹柳三号叶片的脯氨酸、可溶性蛋白含量和超氧化歧化酶活性均显著低于竹柳五号(p < 0.05).因此, 竹柳五号比竹柳三号对重金属胁迫有更强的耐性.而叶绿素、类胡萝卜素、可溶性糖和可溶性蛋白等含量可作为竹柳耐重金属胁迫的评价指标.