1 引言(Introduction)

随着工业的发展，越来越多的有毒的难降解污染物，特别是重金属污染物排入到污水处理厂.目前，我国大多污水处理厂都采取活性污泥法，大量重金属污染物的流入使得活性污泥微生物受到毒性抑制(李艳丽，2014；Cheng et al.，2011)，从而导致COD、氮磷等物质的去除率受到影响，出水难以稳定达标.其中，铬是应用在炼钢、电镀、制革、化工和印染等行业的一类典型的重金属(Vaiopoulou et al.，2012).Novotnik等(2014)研究发现，Cr(Ⅲ)浓度超过50 mg·L^-1或Cr(Ⅵ)浓度超过2.5 mg·L^-1时，活性污泥硝化过程受到抑制影响.Stasinakis等(2002；2003)研究表明，当Cr(Ⅵ)浓度超过5 mg·L^-1时，氨氮去除率在1 d之内就下降70%，超过10 mg·L^-1时，活性污泥的生长就会受到抑制.Fang等(2012)研究发现，Cr(Ⅵ)浓度超过5 mg·L^-1时，生物强化除磷系统(EBPR)的除磷效率就会受到抑制.然而，这些研究主要考察了铬离子对活性污泥的急性毒性(即高浓度铬对活性污泥的冲击)和短期影响(董国日等，2010).根据我国《电镀污染物排放标准》(GB 21900—2008)，总铬排放限值为0.5 mg·L^-1，可知我国实际污水处理厂的进水中铬离子浓度较低.因此，有必要研究低浓度铬对活性污泥系统长期累积效应的影响.活性污泥工艺中微生物群落的变迁与污染物去除效率有极大的相关性，研究低浓度铬对活性污泥细菌群落的影响，特别是关于一些脱氮除磷功能菌的影响机制可以为宏观污染物变化现象提供微观解释.从微观方面，本试验通过高通量测序技术分析低浓度铬对SBR系统微生物群落的影响机制.研究结果对于污水生物处理系统的调控和优化有重要的理论价值和实践指导意义.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 试验用水和活性污泥来源

本试验采用自配制模拟污水，其母液分为5部分，分别为碳源(CH₃COONa 32.03 g·L^-1，无水葡萄糖 23.44 g·L^-1)、氮源(NH₄Cl 38.21 g·L^-1，CaCl₂ 0.45 g·L^-1，MgSO₄ 2 g·L^-1)、磷源(KH₂PO₄ 4.45 g·L^-1)、Cr(Ⅲ)(3.769 g·L^-1)和Cr(Ⅵ)(2.829 g·L^-1).根据试验所需，使用时配比相应的营养物质比例，考虑到模拟混合废水，即有一部分工业废水进入，污染物浓度较高，故初始进水COD、NH₄⁺-N和PO₄^3--P浓度分别设为900、100和12 mg·L^-1.活性污泥取自浙江省杭州市七格污水处理厂，经过1个月的驯化培养后再进行抑制试验.

2.2 试验装置

试验采用SBR工艺，试验装置如图 1 所示.共4套SBR装置，为有机玻璃制成的圆柱体，包含温控隔层，工艺运行由DAC(数值模拟转换器)系统和LABVIEW程序智能控制，反应器内温度通过水浴隔层控制在(25±1)℃，pH和DO通过反馈控制系统分别保持在7.0±0.2和(4.0±0.5)mg·L^-1，污泥浓度(MLSS)通过每天测定计算，控制在(3200±100)mg·L^-1，系统每个周期运行时间为8 h，排水比为1/3.R1和R2系统采用传统的进水-缺氧(150 min)-好氧(300 min)-排泥-排水工艺，而R3和R4系统采用分段进水工艺，即进水1/3-缺氧(45 min)-好氧(90 min)-缺氧(45 min)-好氧(90 min)-缺氧(60 min)-好氧(120 min)-排泥-排水.

2.3 试验方法

本试验共设4套SBR反应器，经过1个月的稳定运行后开始铬抑制试验，R1作为对照组，进水不添加任何浓度的Cr.R2~R4为试验组，R2和R3进水总铬浓度为0.5 mg·L^-1，R4进水总铬浓度为1.0 mg·L^-1，且Cr(Ⅲ)与Cr(Ⅵ)浓度比例为4:1.每天3个运行周期，定期排泥，控制系统MLSS在指定范围内，为了观察SBR系统的处理性能变化，每天测量一个周期的进出水COD、NH₄⁺-N、TN、NO₃^--N、PO₄^3--P和活性污泥的MLSS和SVI，各指标的测定方法见《水和废水监测分析方法》(第4版)(国家环保总局，2002).定期测定活性污泥的EPS，其中，糖原测量采取蒽酮法，蛋白质测量采取Folin-Lowry法(曹秀芹等，2010).在抑制试验的初期和末期分别取活性污泥的DNA，采用高通量测序技术考察细菌群落变化(Li et al.，2013).

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 含铬废水对SBR系统性能的影响

在低浓度铬条件下COD的去除率变化如图 2所示，在0.5 mg·L^-1和1 mg·L^-1总铬条件下，4套SBR系统都保持较高的COD去除率，平均分别为96.8%、96.9%、96.7%和95.7%，相比之下，R4的COD平均去除率最低，说明1 mg·L^-1总铬条件下SBR系统的COD去除率受到了一定的影响.活性污泥工艺水中COD主要靠异养菌的生长代谢所去除，Wang等(2013)研究发现，10 mg·L^-1 Ni(II)会造成SBR系统TOC去除率由90.2%降至75%.Stasinakis等(2002)的研究表明，10 mg·L^-1 Cr(Ⅵ)会对有机物的氧化产生抑制.Cheng等(2011)也发现，SBR工艺的COD去除率在添加5 mg·L^-1 Cr(Ⅵ)条件下由93.6%降至75.8%.说明Cr(Ⅵ)达到一定浓度时，异养菌去除COD的能力会受到抑制作用.综合本试验结果，说明低浓度铬对活性污泥系统中异养菌有一定的抑制影响作用.

SBR系统中氨氮主要通过硝化菌在好氧条件下氧化为硝态氮，硝态氮进而在缺氧条件下通过反硝化菌还原为N₂，系统进水和出水亚硝酸浓度都低于0.3 mg·L^-1，可以认为本试验中不存在亚硝酸盐积累现象.从图 3a可以看出，在总铬浓度为0.5 mg·L^-1和1 mg·L^-1的进水条件下，氨氮去除率在第29 d出现了显著下降，并在后续的试验中持续下降，R2、R3和R4系统的氨氮去除率最终分别下降至70%、65%和40%.说明硝化过程在研究时间段内不会受到低浓度铬的影响，随着抑制时间的增加，系统中活性污泥吸附累积的铬达到了一定限量，抑制了硝化细菌的正常生长和工作，导致了氨氮去除率下降.相比R2和R3系统，在同样总铬浓度进水条件下，分段进水工艺受到的抑制作用更强(第29 d后，R2和R3的氨氮去除率平均值分别为86%和75%)，可能是因为分段进水增加了缺氧和好氧交替次数，从而细菌活动更加频繁，也增加了铬抑制细菌的机会，导致分段进水更早出现抑制现象.由图 3b和图 3c可见，R3和R4系统出水的硝酸盐浓度明显低于R1和R2在硝化过程受到抑制之前(29 d之前)，系统出水硝酸盐浓度平均值分别为R1(15 mg·L^-1)>R2(12 mg·L^-1)>R3(5.8 mg·L^-1)>R4(5.8 mg·L^-1)，总氮去除率大小依次为R3(92%)>R4(90%)>R2(87%)>R1(85%).证实了分段进水模式相比SBR传统A/O工艺具有更高的反硝化效率和总氮去除率.反硝化必须具备缺氧和碳源两个条件，分段进水工艺提供了3次反硝化条件，而传统A/O工艺只有在进水后的缺氧段才有充足的反硝化条件.试验后期氨氮通过硝化转变为硝酸盐氮的过程受到抑制，导致后期系统出水硝酸盐浓度较低，这也造成了后期R2、R3和R4的总氮去除率的变化趋势与氨氮去除率变化相近，在第40 d，分别下降至62%、62%和44%.综合以上结果可得，在长期低浓度铬进水条件下，SBR工艺的硝化过程会受到显著的抑制作用，而且分段进水工艺的硝化过程受到的抑制作用更强；相反，低浓度铬的存在有利于反硝化作用的进行，且分段进水模式相比传统的SBR工艺具有更高的反硝化效率.

如图 4所示，试验前期磷酸盐去除率稳定保持在99%，随着活性污泥中铬渐渐地积累，R2、R3、R4系统在第34、31和27 d陆续出现了磷去除率下降现象，直至试验结束，R2、R3和R4系统磷去除率分别下降至51%、43%和37%.活性污泥系统除磷过程主要依赖于聚磷菌的过量吸磷，研究发现，当EBPR系统中Cr(Ⅵ)高于0.3 mg·L^-1时，其除磷性能逐渐丧失，聚磷菌占全菌的比例由84.26%下降至38.40%(苏斌等，2013).本试验中随着铬离子对SBR系统中活性污泥的不断影响，系统内铬累积的量不断增加，聚磷菌生长代谢过程受到了抑制，导致整个系统除磷效率降低.此外，比较R2和R3系统，同样可发现分段进水工艺更早出现抑制现象，原因可能是分段进水工艺(R3)相比传统SBR工艺(R2)提供更多释磷吸磷交替过程.比较R3和R4系统，可见进水铬浓度越高，抑制现象越早出现，即更易受到抑制影响.总之，在低浓度铬条件下，SBR系统除磷过程受到了显著的抑制影响.

3.2 活性污泥性状的影响

活性污泥性状在本试验中是用SVI值和胞外聚合物分泌量(本试验以多糖和蛋白质为主，DNA和腐殖酸含量很低)来表征，如图 5所示，在0.5 mg·L^-1总铬浓度条件下，活性污泥SVI值基本不受影响，其值始终与R1系统的相接近.然而，在1 mg·L^-1总铬浓度条件下，SVI值在第36 d开始上升，直至第38 d达到160 mL·mg^-1，表明活性污泥出现污泥膨胀现象.

EPS在低浓度铬的影响下也发生了较大的变化，R2、R3和R4系统多糖的分泌能力受到了抑制，最终的分泌量相比初始值分别下降了58.7%、59.6%和67.7%(图 6a).与之相反，由于微生物可以通过促进蛋白质的分泌来抵御铬的生物毒性，因此，试验开始后出现了蛋白质量上升的现象(图 6b).由此可见，0.5 mg·L^-1总铬浓度对SBR系统的SVI值影响不大，但1 mg·L^-1总铬浓度则会引起污泥膨胀；而且低浓度铬对细胞多糖的分泌功能有抑制作用，对细胞蛋白质合成则有促进作用.

3.3 对SBR系统微生物群落的影响

在试验的第1 d和第40 d，提取了活性污泥DNA进行高通量测序.表 1评估了SBR系统微生物群落的丰富度和多样性.表中数据表明，各反应器Coverage值均较高，基本保持在0.996以上，说明本次测序结果具有很好的代表性.OTUs(R1>R3>R2>R4)和Chao1值(R1=R3>R2>R4)表明系统中微生物群落的丰富度，说明在低浓度铬的影响下，活性污泥系统微生物群落的丰富度受到了抑制.Shannon值(R3>R4>R1>R2)表征了系统微生物群落的多样性，可见SBR分段进水工艺的活性污泥群落多样性高于传统SBR工艺，且系统内微生物群落的多样性也受到了铬离子的抑制作用(R2<R1，R4<R3).

主要细菌群落变迁如图 7所示.比较R1和R2系统，可见在低浓度铬的影响下，许多微生物的生长都受到了抑制，如在脱氮过程中起重要作用的Acidobacteria(由22.8%降至1.2%)(Ma et al.，2015)、Planctomycetes(由12%降至1%)(Meng et al.，2015)和Cyanobacteria(由2.2%降至0.03%)，以及在除磷过程中起主导作用的Candidatus_Competibacter(由6.4%降至0.12%)和Candidatus_Accumulibacter(由5.5%降至0.25%)(Slater et al.，2010)等，其在系统微生物群落中所占的比例出现大幅度下降，这也是试验后期氨氮和磷酸盐去除率下降的原因.另外，在强化生物除磷系统中经常出现的Chlorobi(王萍等，2012)也受到了明显抑制(由4.1%降至0.7%).另一方面，低浓度铬的条件也促进了一些细菌的生长，导致其在群落中所占比例大大提升，如Candidate_division_TM7(由13%增至45%)、Bacteroidetes(由13%增至30%)和Zoogloea(由0.8%增至8.8%)等.通过比较R2和R3系统可知，在低浓度铬条件下，SBR传统A/O工艺和分段进水工艺中微生物群落的变化存在差异.Proteobacteria和Thauera作为主要的反硝化细菌，其在R3中所占比例(分别为36%和3%)显著大于R2中所占比例(分别20%和1.1%)，从微观角度证明了分段进水工艺有利于反硝化菌的生长，从而提高了SBR的反硝化效率.同时，分段进水也更有利于某些其他重要菌种的生长，如Rhodocyclaceae(R2：3.2%；R3：11.7%)、Terrimonas(R2：0.4%；R3：2.8%)、Azospira(R2：0.2%；R3：3.5%)和Dechloromonas(R2：0.16%；R3：1.7%)等；比较R3和R4系统可知，在进水铬浓度增大至1 mg·L^-1时，Bacteroidetes(R3：36%；R4：22%)、Acidobacteria(R3：2.3%；R4：0.5%)、Planctomycetes(R3：1.8%；R4：0.4%)、Rhodocyclaceae(R3：11.7%；R4：2.7%)、Nitrospira(R3：0.5%；R4：0.07%)等微生物群落比例都出现了显著的下降.相比其他系统，R4中出现了一种新的微生物群落—BD1-5，并且占据较大比例(19%)，关于BD1-5出现在活性污泥中的报道较少，根据R4在第40 d时出现了污泥膨胀现象推测BD1-5有可能是一种丝状菌.总之，从微生物群落变迁的结果可得，低浓度铬对SBR活性污泥系统微生物群落有一定影响，特别是抑制了许多脱氮除磷功能菌的生长，导致了宏观指标去除率下降的现象.

4 结论(Conclusions)

在含低浓度铬(总铬浓度为0.5 mg·L^-1)进水条件下，SBR系统的COD、氨氮、磷酸盐处理性能、活性污泥性状及系统微生物群落都受到了不同程度的影响.传统工艺和分段进水工艺的氨氮去除率由99%分别下降至70%和65%，同时，磷酸盐去除率也由99%分别下降至51%和43%.比较不同的SBR工艺，可发现分段进水工艺在面对重金属铬的抑制时更加敏感；低浓度铬对活性污泥胞外聚合物也有所影响，多糖的分泌量随铬抑制时间的推移而下降，而蛋白质则呈上升趋势；活性污泥细菌群落结构在低浓度铬的影响下也发生了改变，系统微生物群落丰富度和多样性都受到了抑制影响，Nitrospira、Acidobacteria、Planctomycetes、Cyanobacteria和Candidatus_Accumulibacter等脱氮除磷功能菌的生长都受到了一定程度的抑制，分段进水工艺更有利于其反硝化作用的Proteobacteria和Thauera等细菌的生长.