1 引言(Introduction)

目前，我国土壤重金属污染已较为严重和普遍，而重金属污染土壤的修复也一直是国际上研究的难点和热点(Luo et al.，2012，骆永明，2009).植物修复因具有不产生二次污染、操作简单易行、投资费用低等优点而成为土壤重金属污染修复研究领域中的热点，目前修复植物的选择主要集中于超积累植物、高生物量植物(魏树和等，2004).近年来，能源植物因其自身的优势在重金属污染土壤修复研究中引起越来越多研究者的关注(Visioli et al.，2015).研究表明，能源植物对重金属具有一定的耐受性，是重金属污染土壤修复的良好材料(Bonanno et al.，2013，Huang et al.，2011，Sheng et al.，2012，余海波等，2011).由于矿山开采、重金属污水灌溉等原因，致使我国大面积土壤受重金属污染，选用能源植物作为修复植物既可以修复这些被重金属污染的农田、矿区废弃地，同时还可以发展能源农业，缓解我国发展能源产业所面临的耕地压力，很好地契合了“不与人争粮、不与粮争地”的能源农业发展原则.修复达标后的土地可以重新种植粮食作物，为治理和合理利用重金属污染土壤开辟了一条新的途径，同时可以改善生态环境，增加农民收入(Weyens et al.，2009).

与超积累植物相比，能源植物在修复重金属污染土壤过程中易受到土壤中高浓度重金属的胁迫，同时有些能源植物对生长的土壤水肥条件要求较高，在营养成分缺乏的污染土壤(如矿区废弃地等)中生长受到限制，从而限制其修复效率.土壤中微生物种类多、数量大、生物活性高，在重金属污染土壤中修复植物的生长及重金属的地球化学循环过程中起到重要作用.土壤中有些细菌能通过溶磷、固氮等途径改善植物营养，以及通过分泌植物激素、铁载体、特异性酶、抗生素等作用，促进修复植物在逆境条件下的生长和对重金属的富集，提高能源植物修复土壤重金属的效率(Teng et al.，2015; 马莹等，2013).因此，开展能源植物修复土壤重金属污染过程中细菌群落和功能研究，将对阐明能源植物耐受重金属污染机理及其调控具有重要意义.

目前，在能源植物修复土壤重金属污染过程中，针对能源植物根际土壤细菌群落组成和功能研究的工作开展较少，少量已开展的工作或采用传统平板分离法或采用非培养的变性梯度凝胶电泳法(PCR-DGGE)等不全面和有选择性的方法，需要继续深入.以高通量测序为代表的新一代测序技术凭借低成本、高通量、流程自动化的优势为研究微生物群落结构提供了新的技术平台，大大推动了环境基因组研究的快速发展，该方法的应用将为探明能源植物修复土壤重金属污染过程中根际土壤、内生细菌群落组成和功能提供帮助(Visioli et al.，2015).基于此，本研究选取具有多种重金属抗性的油脂类能源植物大豆和碳水化合物类能源植物玉米，采用高通量测序方法研究大豆、玉米修复镉污染土壤过程中根际土壤细菌群落组成，以期为了解重金属污染土壤-能源植物复合生境中细菌群落组成、优化重金属抗性植物促生细菌的筛选方案及能源植物耐受重金属机制的阐明提供理论依据和技术支持.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 盆栽种植

土壤采自河南省南阳市东郊0~15 cm表层土(坐标为北纬32°99′，东经112°47′)，土壤风干后过20目筛，去除植物组织和石块，加入分析纯CdSO₄·8H₂O使土壤中Cd的含量分别为0和100 mg·kg^-1，充分混合并放置1个月后装盆，备用.大豆品种中黄57分别种植于0 mg·kg^-1 Cd污染土壤(样品编号为S1、S2、S3)和100 mg·kg^-1 Cd污染土壤盆钵中(样品编号为S4、S5、S6)，玉米品种为郑单958(Cd 0 mg·kg^-1样品编号为Z1、Z2、Z3；Cd 100 mg·kg^-1样品编号为Z4、Z5、Z6)，以不种植物为对照组(Cd 0 mg·kg^-1样品编号为CK1、CK2、CK3；Cd 100 mg·kg^-1样品编号为CK4、CK5、CK6)，每个样品3个重复，盆栽试验于南阳师范学院农业工程学院温室进行，种植时间为2015年4—6月，共60 d，期间保持土壤含水量为供植物生长所需的水分.植物收获处理时沿土面剪取植株地上部，分为茎部和叶部，将根系与土壤小心分离并收集根际土，将根际土放入无菌纸袋中，用于后续土壤DNA提取.

2.2 重金属含量测定

植物组织置于烘箱中105℃烘干，磨碎后准确称取样品于消煮管中用HClO₄/HNO₃(优级纯，体积比13：87)的混合酸液进行消解，电感耦合等离子发射光谱仪ICP-AES(Optima 2100 DV，Perkin Elmer)测定溶液中的Cd含量.

2.3 壤DNA提取

根际土壤细菌总DNA提取采用FastDNA^® Spin Kit for Soil试剂盒(MP Biomedicals，USA)，按照说明书的提取步骤进行，将提取得到的土壤总DNA通过微量紫外分光光度计(NanoDrop^®ND-1000，Wilmington，DE，USA)测定DNA浓度和纯度.

2.4 高通量测序

采用通用引物(338F/806R)对土壤细菌16S rRNA基因的V3~V4区扩增，修饰后的通用引物含有不同的Tag标签用以区分不同样品.PCR扩增体系为20μL，其中含5×FastPfu Buffer 4μL、2.5 mmol·L^-1 dNTPs 2μL、Forward Primer(5μmol·L^-1)0.8μL、Reverse Primer(5μmol·L^-1)0.8μL、BSA(10 mg·mL^-1)0.2μL、FastPfu Polymerase 0.4μL、DNA模板10 ng，补ddH₂O至20μL.PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环；72℃延伸10 min.每个样品3个重复，将不同样品的PCR扩增产物均一化至10 nmol·L^-1后等体积混合，利用上海美吉生物医药科技有限公司的MiSeq PE300测序仪(Illumina Inc.，San Diego，CA，USA)完成序列测定.对获得的原始数据进行质量控制，截断或舍弃低质量序列，用软件Flash连接通过质量控制的序列对应的两端序列，舍弃无法连接的序列.根据试验要求，对连接上的序列进行过滤，获得最终用于分析的序列.

2.5 数据分析

高通量数据的生物信息学分析采用Qiime(Quantitative Insights into Microbial Ecology)进行，根据序列的相似度，将序列归为多个OTU(Operational Taxonomic Unit)，OTU产出后，统计各个样品含有OTU情况及每个OTU中含有序列的数目，通过寻找最近亲缘物种的方法，得到每个OTU的分类学信息.选取相似度在97%条件下的OTU生成预期的稀释曲线，并利用软件Mothur计算丰富度指数Chao1和ACE，覆盖度指数(Good′s Coverage)及多样性指数(Simpson和Shannon指数)用于进行Alpha多样性分析.利用PCoA、Correlation聚类法分别进行数据处理、细菌群落分布、主成分分析和聚类分析.

其他数据分析在SPSS 17.0中进行，采用方差分析差异性，显著性水平设定为p < 0.05.相关图表制作在Excel中完成.

3 结果(Results) 3.1 生物量及镉含量

从图 1a可以看出，100 mg·kg^-1 Cd的添加会抑制玉米、大豆生长，不同组织生物量与无污染对照相比均有所降低，幅度为24.53%~75.75%，其中，大豆降低量比玉米高，根、茎、叶生物量降低均超过60.67%.不同组织Cd含量测定结果表明，根部Cd含量最高，其次为茎部和叶部(图 1b).结合不同组织生物量，可以得出玉米、大豆不同组织Cd积累总量(图 1c)，根部Cd积累量最高，两种植物根部Cd积累量均超过植物Cd总积累的64.11%，转移系数TF(植物地上部重金属含量与根中该元素含量的比值)分别为玉米0.56、大豆0.14.

3.2 土壤细菌群落组成

高通量测序结果表明，18个实验样品文库覆盖率均在99%以上，能够反映样品中细菌群落的种类和结构.18个实验样品平均序列条数为32769，OTUs平均数1563，经过分析发现，主要为细菌的33个门，包括Proteobacteria(变形菌门)、Acidobacteria(酸杆菌门)、Gemmatimonadetes(芽单胞菌门)、Actinobacteria(放线菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)、Candidate_division_TM7、Chloroflexi(绿弯菌门)、Fibrobacteres(纤维杆菌门)、Armatimonadetes等(图 2).其中，属于Proteobacteria、Acidobacteria、Gemmatimonadetes、Actinobacteria门的序列总和占全部序列的63.57%，这些微生物为优势种群.

3.3 镉对细菌群落的影响

研究表明，重金属污染能够明显影响土壤的微生物群落，利用Qiime软件对无污染的9组和添加100 mg·kg^-1 Cd的9组实验样品相关细菌群落进行了PCoA分析(主坐标分析)(图 3).如图 3所示，PC1贡献度为65.09%，PC2贡献度为13.24%，无污染土壤不种植物处理(CK1、CK2、CK3)、种植玉米(Z1、Z2、Z3)和大豆处理(S1、S2、S3)聚集在PCoA分析图左侧，添加100 mg·kg^-1 Cd土壤不种植物处理(CK4、CK5、CK6)、种植玉米(Z4、Z5、Z6)和大豆处理(S4、S5、S6)聚集在PCoA分析图右侧，横坐标PC1能将无污染组和添加100 mg·kg^-1 Cd污染组相关细菌群落构成区分开，表明添加100 mg·kg^-1 Cd对土壤细菌群落结构影响最大.后续使用基于Unifra的UPGMA方法对无污染组和添加100 mg·kg^-1 Cd污染组间细菌群落构成的相似性进行聚类分析.通过样品加权的聚类分析，同样可以有效地将无污染组和添加100 mg·kg^-1 Cd污染组实现组间聚类(图 2).

为了进一步揭示Cd污染对能源植物根际土壤细菌相对丰度的影响，分析了每个样品中细菌在科水平上相对丰度热图(图 4).由图 4可知，下降的细菌主要有Gemmatimonadaceae、Acidobacteriaceae_Subgroup_1、Subgroup_6_norank、Haliangiaceae、SC-I-84_norank、Solimonadaceae、Pseudomonadaceae、Micrococcaceae、Bacillaceae、Nocardioidaceae、Pseudonocardiaceae、Streptomycetaceae、Enterobacteriaceae等，上升的细菌主要有Sphingomonadaceae、Cytophagaceae、Subgroup_3_incertae_sedis、Halomonadaceae、Xanthobacteraceae、Chitinophagaceae、Anaerolineaceae、Caulobacteraceae等.其中，Gemmatimonadaceae的Gemmatimonas在不种植物处理和种植玉米组相对丰度下降显著，种植大豆组相对丰度上升明显.与此相似，Chitinophagaceae的Flavisolibacter在不种植物处理相对丰度有所下降，种植玉米和大豆组相对丰度上升明显.

3.4 能源植物种植对土壤细菌群落的影响

为了研究种植能源植物大豆和玉米对土壤微生物群落的影响，对相关实验样品细菌群落进行了PCoA分析(图 3).如图 3所示，PC1贡献度为65.09%，PC2贡献度为13.24%，无污染土壤不种植物处理(CK1、CK2、CK3)和种植玉米(Z1、Z2、Z3)处理聚集在纵坐标PC2上部，种植大豆处理(S1、S2、S3)聚集在纵坐标PC2下部，表明无污染土壤中种植玉米对土壤细菌群落结构影响较种植大豆要小.添加100 mg·kg^-1 Cd土壤不种植物处理(CK4、CK5、CK6)聚集在一起，种植玉米(Z4、Z5、Z6)和大豆处理(S4、S5、S6)互相聚集在一起，且相互距离较近，在纵坐标PC2分布较无污染处理组更为集中，表明100 mg·kg^-1 Cd污染土壤中种植玉米和种植大豆均能影响土壤群落结构，但影响较无污染处理组要小.后续使用基于Unifra的UPGMA方法对相关实验样品细菌群落构成的相似性进行了聚类分析.通过样品加权的聚类分析，同样可以有效地将部不种植物组、种植大豆和种植玉米组实现组间聚类(图 2).

通过每个样品中细菌在科水平上相对丰度热图(图 4)可以看到不同污染土壤(无污染和100 mg·kg^-1 Cd污染)大豆、玉米种植对细菌群落的影响.上升的细菌主要有Candidate_division_TM7_norank、Micrococcaceae、Chloroplast_norank、Streptomycetaceae、Burkholderiaceae、Bacillaceae、Pseudonocardiaceae、Gemmatimonadaceae、Chitinophagaceae、Cytophagaceae、Anaerolineaceae等，主要下降的细菌有Acidobacteriaceae_Subgroup_1、Subgroup_6_norank、Sphingomonadaceae、Nitrosomonadaceae、Gemmatimonadaceae、Chitinophagaceae、Xanthobacteraceae、Halomonadaceae等.其中，在无污染条件下大豆、玉米种植能显著提高Micrococcaceae的Arthrobacter丰度，但在100 mg·kg^-1 Cd污染条件下丰度均有所降低，Roseiflexaceae的Roseiflexus、Geodermatophilaceae的Blastococcus、Xanthomonadaceae的Arenimonas变化与此类似.在100 mg·kg^-1 Cd污染条件下，大豆、玉米种植能显著提高Chitinophagaceae的Flavisolibacter、Cytophagaceae的Flexibacter、Comamonadaceae的Ramlibacter、Cytophagaceae的Ohtaekwangia和Chitinophagaceae的Flavitalea丰度，但在无污染条件下丰度有所降低.100 mg·kg^-1 Cd污染条件下，大豆种植对Gemmatimonadaceae的Gemmatimonas丰度提高最为显著，但其他处理组丰度均下降明显.

4 讨论(Discussion)

之前能源植物修复土壤重金属污染过程中，能源植物根际土壤细菌群落组成采用传统平板分离法或采用非培养的变性梯度凝胶电泳法(PCR-DGGE)等不全面和有选择性的方法(Chen et al.，2013，Visioli et al.，2015).本文采用高通量测序(Illumina公司MiSeq测序平台)方法研究大豆、玉米修复土壤Cd污染过程中根际土壤细菌群落组成，发现其主要由Proteobacteria、Acidobacteria等33个门细菌组成，重金属Cd的添加和玉米、大豆种植均能影响土壤细菌群落组成.Cd添加能提高Sphingomonadaceae、Cytophagaceae等细菌丰度，其中，种植大豆组Gemmatimonadaceae的Gemmatimonas相对丰度上升明显，种植玉米和大豆组Chitinophagaceae的Flavisolibacter相对丰度上升明显.在100 mg·kg^-1 Cd污染条件下，大豆、玉米种植能显著提高Chitinophagaceae的Flavisolibacter、Cytophagaceae的Flexibacter、Comamonadaceae的Ramlibacter、Cytophagaceae的Ohtaekwangia和Chitinophagaceae的Flavitalea丰度，但在无污染条件下丰度有所降低.100 mg·kg^-1 Cd污染条件下，大豆种植对Gemmatimonadaceae的Gemmatimonas丰度提高最为显著，但其他处理组丰度均下降明显.比较分析发现，以上菌株可能在大豆、玉米耐受、富集Cd过程中起到重要作用.

研究表明，重金属污染等逆境条件下植物根际土壤存在大量功能细菌，这些具有植物促生特性、污染物降解能力等功能的可培养细菌在植物生长、污染物降解及植物耐受逆境胁迫等方面起到重要的作用(Picard et al.，2003，Timmusk et al.，2011).这些土著微生物性能稳定、适应性强，同时与植物长期协作，形成良好的关系，如应用于重金属污染土壤植物-微生物联合修复将能很好地克服限制其修复效率的因素，具有良好的应用前景.但在复杂的微生物群落中找出控制生态功能的关键种群是生态学研究中的一个难点，鉴于微生物群落的复杂性、多样性，找出微生物群落中的关键种十分困难.之前植物-微生物联合修复土壤污染研究中细菌筛选多采用LB、SLP等培养基进行富集培养、纯化，测定其重金属抗性和植物促生特性(IAA、铁载体、ACC脱氨酶等)，从而获得重金属抗性植物促生细菌，用于后续植物-微生物联合修复.采用该方法国外研究者已从超积累植物东南景天(Sedum alfredii)、遏蓝菜(Noccaea caerulescens)、庭荠属(Alyssum murale)、印度芥菜(Brassica juncea)及能源植物油菜、玉米等根际土壤和植物内生分离筛选到Bacillus、Pseudomonas、Sphingomonas、Agrobacterium、Burkholderia等重金属抗性促生菌株(Visioli et al.，2015)，并对能源植物油菜(Chen et al.，2013；He et al.，2013)、甜高粱(Luo et al.，2012)、玉米(Li et al.，2014；Sheng et al.，2012)、向日葵(Huo et al.，2012；Rojas-Tapias et al.，2010)、大黍(Huo et al.，2012)等接种植物促生细菌，研究其对能源植物生长和修复土壤重金属效率的影响.但该方法所采用的LB、SLP等培养基具有选择性，只能筛选适宜该种培养基生长的菌株，具有较大的局限性和盲目性，工作量大.并且未针对采集样品本身的菌群结构设计筛选条件，所分离菌株可能不是植物修复土壤重金属污染过程中关键种群，联合修复作用效果上不稳定，限制了植物-微生物联合修复的实际应用.

随着高通量测序技术在微生物生态研究中的应用，为微生物群落中的关键种群提供了有效途径.Feng等(2015)利用高通量测序和克隆文库对我国华北平原潮土土壤微生物群落结构的研究发现，一种类Bacillus asahii细菌对长期施用有机肥的响应最为显著，而且它是潮土中的土著微生物；同时设计了筛选方案，获得了该菌株，对其进行生理生化分析发现，该物种有着不同于其它芽孢杆菌的生理特征，以及具有丰富的代谢多样性；回接实验显示，该菌株能够加速和促进其它微生物对潮土有机质累积和磷素循环过程，在作物生长和土壤地力中起到领军性的作用.以上研究表明，通过高通量测序分析复杂生境中微生物群落组成，确定关键种群，以此指导重要功能菌株的筛选，具有重要的应用前景.

本文实验结果表明，Cd添加和玉米、大豆种植均能影响土壤细菌群落组成，Cd添加和大豆、玉米种植能改变Gemmatimonas、Flavisolibacter、Flexibacter、Ramlibacter、Ohtaekwangia、Flavitalea丰度，后续实验如能针对以上种属菌株设计筛选方案，获得其可培养菌株，研究其生物学特性并进行能源植物-细菌联合修复实验，将具有良好的应用前景并能很好的阐明能源植物修复土壤重金属污染过程中的微生物机理.

5 结论(Conclusions)

1) 100 mg·kg^-1 Cd的添加会抑制油脂类能源植物大豆和碳水化合物类能源植物玉米生长，生物量降低比例为24.53%~75.75%.两种植物根部Cd含量和积累量最高，根部Cd积累量均超过植物Cd总积累的64.11%，转移系数TF分别为玉米0.56、大豆0.14.

2) 高通量测序结果表明，大豆、玉米根际土壤细菌由Proteobacteria、Acidobacteria等33个门细菌组成，Cd添加和玉米、大豆种植均能影响土壤细菌群落组成，能影响Gemmatimonas、Flavisolibacter、Flexibacter、Ramlibacter、Ohtaekwangia、Flavitalea等丰度.

3) 高通量测序在能源植物修复土壤重金属污染研究中的应用，能阐明能源植物修复土壤重金属过程种群落组成及其影响因素，也将为性能稳定、适应性强、能良好匹配土壤类型、重金属含量和修复植物的土著促生细菌筛选创造良好条件，提高能源植物-促生细菌联合修复实际修复效率.