2016, Vol. 36
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2. 西北农林科技大学生命科学学院, 杨凌 712100;
3. 农业部西北植物营养与农业环境重点实验室, 杨凌 712100
2. College of Life Sciences Northwest A&F University, Yangling 712100;
3. Key Laboratory of Plant Nutrition and the Agri-environment in Northwest China, Ministry of Agriculture, Yangling 712100
镉(Cd)是广泛存在自然界且没有任何生物学功能的重金属元素，被认为是环境污染中最危险元素之一(Vig et al.，2003 ，其主要随污灌、采矿、冶炼等活动进入环境，影响水体和土壤质量，并通过食物链威胁人畜健康(Luo et al.，2009Karace et al.，2010 .据统计2006年我国镉污染耕地面积约2 万hm2，每年生产的镉超标农产品1.46×109 kg；2014年全国土壤污染调查公报显示土壤污染总超标率16.1%，其中Cd严重污染点位超标率达7%(环境保护部和国土资源部，2014).可见Cd已成为我国农田土壤污染的主要重金属之一.镉污染不仅会使土壤微生物生物量减少，而且还会引起微生物群落的结构和功能甚至遗传多样性发生改变(Giller et al.，1998Gans et al.，2005 .硝化作用是土壤中主要的生物化学过程，其由两种化能自养细菌作用，先后将NH4+-N氧化为NO2--N和NO3--N，在全球N循环中占据重要地位.因此有必要探讨Cd对农田土壤硝化活性的影响.
国内外学者先后对铜、镍、锌、汞和银污染的土壤硝化活性进行了研究，发现硝化活性可较好指示土壤污染的程度(Smolders et al.，2004Oorts et al.，2006Broos et al.，2007Liu et al.，2010 Langdon et al.，2014孙晋伟等，2008；林蕾等，2012)，并揭示出土壤pH、粘粒含量、有机碳含量和阳离子交换量是影响二者关系的主要因素.但针对Cd污染土壤，Smolders发现外源2 mg·kg-1 Cd时农田土壤硝化活性降低14%(Smolders et al.，2001) ，而Dušek却认为10 mg·kg-1 Cd导致土壤硝化活性增高(Dušek，1995)，可见硝化活性对土壤Cd污染响应并不一致.现有研究多是采用某一地区土壤完成，应用很难有普遍性；加之我国地域辽阔，土壤类型丰富，土壤性质差异较大，因此亟需开展我国主要类型土壤上Cd的土壤硝化活性效应研究，以便更好服务国家环境保护事业.本文选取我国10种类型的12个土样，采用模拟方法，探讨Cd污染后土壤硝化活性的变化规律，并揭示影响二者关系的主要控制因素，最终为土壤污染评估及调控提供重要依据
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 供试土壤采自我国12个省份的典型类型、未污染农田土壤.采样时先去除0～5 cm表层后，采集5～20 cm土壤，风干，过1 mm尼龙筛备用.常规方法测定土壤基本理化性质(鲁如坤，2000)，HCl-HNO3-HF-HClO4高温高压密闭消解法、ICP-MS(X-7，Thermo-Elemental，USA)测定土壤Cd背景值，同时采用国家标准土壤(酸性砖红壤和碱性黄土)为Cd的质控样.结果见表 1.
| 表 1 供试土壤基本理化性质 Table 1 Physico-chemical properties of soils |
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调节风干土样水分至最大饱和持水量的60%，在25 ℃活化14 d后，称取5.00 g鲜土，分别加入不同浓度的 Cd2+(3(CdSO4)·8H2O)溶液，使土壤最终Cd含量分别为0、0.6、5、25、50、100、200、300、500 mg·kg-1干土，混匀并稳定30 min后，加入0.1 mL 1.5 mol·L-1 NaClO3和20 mL 1 mmol·L-1(NH4)2SO4溶液，25 ℃培养8 h后，添加5 mL 2 mol·L-1 KCl溶液振荡，滤液采用对氨基苯磺酰胺比色法测定NO2-含量，计算硝化活性(Kurola et al.，2005 .每处理重复3次，并设无底物、无土壤处理作对照.
2.3 数据分析及统计 2.3.1 逻辑斯蒂克分布模型(Log-logistic distribution)(Doelman and Haanstra，1986 )：
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(1) |
(Full inhibition model)(Speir et al.，1995) ：
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式中，y 为硝化活性，x 为土壤Cd含量(mg·kg-1)，a(A)为污染物浓度为0 mg·kg-1的土壤硝化活性理论值，b为剂量-效应曲线斜率，B 为一定底物浓度下受到抑制常数Ki、最大反应速度Vmax和米氏常数Km及抑制类型等共同作用下形成的复合参数，c 为生态剂量(Ecological dose，ED)以10 为底的对数值.
通过拟合曲线来计算出土壤硝化活性的生态剂量(Ecological dose)ED25、ED50值(其分别代表处理硝化活性是未污染土壤硝化活性变幅为25%、50% 时土壤Cd浓度).方程拟合及多重比较等采用SPSS18.0软件完成的.
3 结果和讨论(Results and discussion) 3.1 供试土壤硝化活性变化对照处理土壤硝化活性结果见图 1，可看出土壤的硝化活性变化较大，且大多数达到了显著差异，其值为35～258 μg·kg-1·h-1，其中滨海盐土、褐土和塿土硝化活性最高，分别达258、251和246 μg·kg-1·h-1，而灌淤土和红壤的较低，仅34.49和39.29 μg·kg-1·h-1，最大相差达7.48倍.表明土壤类型和性质等对硝化活性影响较大.
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| 图 1 供试土壤的硝化活性 Fig. 1 Soil nitrification activities |
不同类型土壤硝化活性存在较大的差异，这主要是由于供试土壤分属于10种类型，理化性质差异较大，如有机质、粘粒、阳离子交换量的最大变幅分别为5.57、6.05、3.83 倍，从而导致土壤微生物数量变化较大.在本研究中土壤pH范围在6.8到8.2 之间时，土壤硝化活性相对高于其他土壤.有研究表明土壤pH为4.6～5.1时硝化作用不明显，当pH为5.8～6.0 时土壤硝化作用缓慢进行，而pH为6.4～8.3时硝化作用最强烈(Katyal et al.，1988 ；而且土壤硝化活性与土壤pH 存在显著正相关(Dancer et al.，1973；Smolders et al.，2001) .主要是因为土壤中NH3的有效性随pH降低呈指数下降，从而减少氨氧化细菌或古菌对底物的利用(Nicole et al.，2008).但在本研究中土壤硝化活性与pH并未达到显著相关，仅与土壤硝态氮含量(r=0.607，p﹤0.05) 呈显著相关，这可能是由于供试土壤pH分布不均匀，多数集中在8.0左右的缘故.此外除土壤pH外，无定形铁、碳酸钙、CEC、矿质氮、全磷和氯离子等都会影响到土壤硝化作用的强弱(Megda et al.，2014张树兰等，2000;鲍俊丹等，2009；孙波等，2009).故研究硝化活性与重金属关系时，必须考虑土壤性质对硝化活性的直接影响.
3.2 Cd对土壤硝化活性的影响从不同Cd浓度下土壤硝化活性结果(图 2)可看出，(1) Cd加入后，不同类型土壤的硝化活性变化大相径庭，如乌栅土硝化活性增加，在500 mg·kg-1 Cd时增幅达130%；黑土呈波动性变化，幅度为-12.29%～14.69%，其余土样则降低.可能是由于乌栅土和黑土的有机碳、粘粒含量及阳离子交换量较高(表 1)，从而降低了Cd的有效性(Tan et al.， 2014) . (2) 随镉浓度增加，除乌栅土和黑土外，潮土2和滨海盐土硝化活性则呈现为低剂量升高，高剂量抑制的变化；其中当Cd浓度增加至100 mg·kg-1后，土壤硝化活性急剧降低；特别是Cd浓度达到200和500 mg·kg-1时，潮土1、灌淤土和粟钙土的硝化活性均降至0 μg·kg-1·h-1.表明高浓度的Cd强烈地抑制大多数土壤的硝化活性. (3) 在国家土壤质量的二级污染标准浓度(0.6 mg·kg-1)时，除潮土1硝化活性降低48.55%外，其余土壤硝化活性变化较小，变幅-12.29%～15.26%，且均未达显著水平差异.揭示出土壤硝化活性对二级污染标准浓度响应不灵敏，从侧面反映出我国标准制定的严格性.由于黑土和乌栅土硝化活性并未受到外源Cd的抑制，因此这两种土壤不参与剂量-效应关系的模型拟合.
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| 图 2 Cd对土壤硝化活性剂量-效应曲线 Fig. 2 Dose-response curves between Cd contents and soil nitrification activities |
其余土壤采用Logistic和完全抑制模型进行拟合，结果见表 2、3，反映出：①拟合方程均达极显著水平，揭示土壤硝化活性在一定范围内可表征土壤Cd污染程度，可作为土壤Cd污染的监测辅助指标；②完全抑制模型结果揭示出Cd与土壤硝化活性之间存在一种完全竞争(包括竞争性抑制和非竞争性抑制)作用机理；③土壤Cd的生态剂量ED差异较大，其中Logistics模型获得的ED25为2.44～363.03 mg·kg-1、ED50为10.99～553.64 mg·kg-1；完全抑制模型计算的生态剂量值ED25为5.58～335.35 mg·kg-1、ED50为16.73～1006.04 mg·kg-1；可见一方面不同模型获得的生态剂量值存在差异，另一方面不同土壤的ED值差异较大，如Logistics计算出的ED25和ED50最大(滨海盐土)和最小值(盐土1) 分别相差149和50倍.④根据ED值越小，反应越敏感的原则，从土壤硝化活性角度获得我国土壤轻度Cd污染的临界浓度为2.44 mg·kg-1，高于国家土壤质量中的二级污染标准.
| 表 2 Logistic模型参数和Cd生态剂量值 Table 2 Parameters of Logistic equation and Cd ecological dose |
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| 表 3 完全抑制模型参数和Cd生态剂量值 Table 3 Parameters of full inhibition model and Cd ecological dose |
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由于Logistic模型的显著水平更高、更符合实际，故在筛选二者关系主控因素时，采用Logistic模型的生态剂量来完成多元逐步回归拟合.由Cd 生态剂量与土壤性质间回归结果(表 4)可知，土壤有机碳(TOC)含量控制ED25变异的79.1%.土壤CEC控制ED50变异的80.4%.当引入第二个因子土壤pH到ED50值回归模型后，模型预测的准确性进一步提高，两因子的变化共同解释了回归模型变异的95.6%，所以影响Cd的ED50值的主要因素是CEC和pH.
| 表 4 基于土壤主控因子和生态剂量的简单和多元逐步回归方程 Table 4 Simple and multiple regression for ecological dose and soil properties |
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将从方程3(表 4)获得的土壤ED50预测值与实测值进行比较，发现二者呈极显著正相关(r=0.749**，p＜0.01，n=10) ；但是由于红壤ED50预测值与实测值相差770倍，表明Cd对红壤土壤硝化活性的生态剂量值不宜采用方程3来预测.在排除红壤后，实测和预测值间也达极显著相关(r=0.883**，p﹤0.01，n=9) ，且相关系数更高.线性回归图(图 3)显示全量Cd预测值和实测值中8个土壤处于95% 置信区间，1个位于95% 置信区间之外.因此利用土壤CEC含量和pH通过方程3能很好地预测土壤(pH在6.82以上)外源Cd对硝化活性生态剂量及污染临界值.
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| 图 3 测定的硝化活性生态剂量和预测的生态剂量之间的相关性(全量Cd) Fig. 3 Relationship between measured and predicted ecological doses to potential nitrification activities(Total Cd) |
供试土壤硝化活性对Cd的响应并不一致.低剂量Cd可抑制潮土1的硝化活性，但对黑土硝化活性影响不显著，而促进了乌栅土硝化活性.重金属在土壤中的环境行为(吸附和解吸过程)是受到土壤pH、有机碳、粘粒、CEC和Eh等性质影响，进而影响重金属在土壤中赋存形态和毒性(Giller et al.，2009 .由土壤理化性质可知(表 1)，相比其他类型土壤，乌栅土和黑土有机碳、粘粒含量以及阳离子交换量均较高；而潮土1和灌淤土的有机碳、粘粒含量以及阳离子交换量均偏低；另外通过对污染土壤中水溶态Cd的研究表明，潮土1和灌淤土中水溶态Cd浓度均高于乌栅土和黑土，这导致Cd在土壤中呈现出不同的生物毒性(Tan et al.，2014).其他的研究中也获得类似的结果，如基于土壤微生物还原Fe(Ⅲ)过程测定Cd毒性，得出ED10在5~95 mg·kg-1之间(Welp and Brümmer，1997)，Cd对土壤芳基硫酸酯酶活性的ED10为3.4~28.1 mg·kg-1(Haanstra and Doelman，1991).表明不同种类的土壤具有不一样的生态剂量值，揭示出土壤性质是影响Cd生物毒性的重要因素.为此本文对理化性质的影响进行了定量化分析，多元回归分析表明土壤CEC和pH是控制Cd对硝化活性毒性的主要因子，其在一定程度上解释95.6%的变异信息，可用来预测不同类型和性质土壤中Cd对硝化活性的毒性阈值(图 3).
另一方面Cd对土壤硝化活性、芳基硫酸酯酶活性、微生物还原Fe(Ⅲ)活性的Cd的 ED10(2.44、3.4和5 mg·kg-1)值均大于国家土壤质量标准中的二级污染标准(0.6 mg·kg-1).Vig等(2003) 认为Cd通常在较高的浓度才会对微生物生物量、硝化活性等微生物学指标产生抑制效应.因为微生物普遍具有3种抗Cd的转运蛋白(P-type ATPase、CBA transporters和CDF family transporters)从而抵御环境中Cd的胁迫(Saluja et al.，2011 ，且不同土壤微生物群落对重金属的抗性也不同(Smolders et al.，2001 .本研究主要关注Cd对土壤硝化活性的急性毒性.然而，重金属进入土壤后，其有效性随时间而发生改变；同时微生物群落对重金属都具有一定的抵抗力和恢复力，短时间内的一些抑制现象可能随着时间的延长而消失.因此，有必要对Cd老化过程中土壤硝化活性的响应方式做进一步的研究
4 结论(Conclusions)综上所述我国不同类型土壤的硝化活性差异较大，且土壤硝化活性对外源Cd的响应不一，这主要是由于土壤性质差异所导致的；剂量-效应关系可用Logistic和完全抑制模型很好的拟合，揭示出在一定程度上可表征我国主要类型土壤上的Cd污染程度，Cd对硝化活性的作用机理为完全抑制(包括竞争性抑制和非竞争性抑制)作用.不同土壤的性质对Cd的生态剂量值具有显著的影响，基于土壤主要性质中的CEC含量和pH这两个因子的回归方程能很好地预测土壤中外源Cd对硝化活性的抑制作用.从土壤硝化活性得到我国主要类型土壤Cd污染临界值为2.44 mg·kg-1.
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