2016, Vol. 36
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2. 上海市水产养殖工程技术研究中心, 上海 201306;
3. 上海市奉贤区水产技术推广站, 上海 201499
2. Shanghai Engineering Research Center of Aquaculture, Shanghai 201306;
3. Fengxian Fisheries Technology Extension Station, Shanghai 201499
淡水蓝藻水华过程中产生的蓝藻毒素威胁着水域生态系统的健康，其中尤以蓝藻肝毒素危害最为严重(Cristiana et al.，2013).节球藻毒素(Nodularin，NOD)是由泡沫节球藻(Nodularia spumigena)产生的一种环五肽肝毒素(江敏等，2014)，其结构与微囊藻毒素(Microcystin，MC)类似，具有严重的肝毒性、基因毒性、胚胎毒性和遗传毒性(Chen et al.，2013；Meneely et al.，2013；郝纪荣等，2013；江平，2014)，同时还是肿瘤的引发剂和促进剂，并可以在生物和环境中进行富集和转化(Karjalainen et al.，2008).通常情况下水体中NOD含量极低，仅为ng·L-1级，而在水华水体中却可以达到几百甚至几千μg·L-1(Hanna et al.，2008；Kankaanp et al.，2009).有研究表明，饮用水中藻毒素的残留与我国南方原发性肝癌的高患病率有密切的相关性(谢平，2009)，因此，寻找高效的节球藻毒素去除方法已经成为当前迫切需要解决的问题.
NOD化学性质稳定，传统的过滤及混凝沉降技术难以将其有效去除，而现存的一些去除方法，如活性炭吸附法、膜滤法、化学试剂氧化法、臭氧氧化法、生物降解法等往往受到成本、能耗、去除效率及反应副产物的限制，难以有效实施(江敏等，2014).近年来，高级氧化法中的光降解技术由于效率高、污染小、成本较低等优势受到了极大的关注，光解藻毒素的实验研究多集中于微囊藻毒素，并且取得了较好的效果.Senogles等(2000)的研究表明，紫外光照射可在45 min内将一定初始浓度的微囊藻毒素完全降解；陈晓国等(2004)则比较了微囊藻毒素在UVA(λ=320~400 nm)和UVC(λ=200~275 nm)照射下的降解效果，结果表明，虽然UVC的强度远远小于UVA，但其对MC的降解速率却比UVA高出将近2个数量级.目前对于节球藻毒素的光降解研究甚少，仅国外部分文献有所提及，Hayley等(1997)比较了NOD在UVA(λ=320~420 nm)和UVB(λ=275~320 nm)下的去除效果，结果表明，NOD在UVA的照射下浓度几乎没有变化，而在UVB照射24 h后浓度有明显下降；Iain等(2005)则使用UVB光源配合TiO2催化剂去除水体中NOD，反应60 min后NOD去除率超过99%.节球藻毒素作为一类危害较大的蓝藻肝毒素，关于其光降解的研究多集中于UVA和UVB光源，UVC及可见光源的研究较少，此外，几乎未见关于NOD光解最优条件及反应动力学的研究.因此，本实验利用纯化的节球藻毒素比较紫外光、可见光及暗反应下的NOD去除效果，继而选择UVC作为实验光源，研究其去除NOD的影响因素及反应动力学，以期寻找一种便捷的NOD去除方法.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 试剂与仪器试剂：节球藻毒素标准品，购自瑞士Alex公司，纯度≥96%；甲醇和水均为色谱级，购自国药集团化学试剂有限公司；三氟乙酸(TFA)为分析纯，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；纳米二氧化钛购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度99.8%，粒径25 nm，锐钛型.
仪器：德国eppendorf 5810R型离心机、数显恒温磁力搅拌器、紫外辐照计、氮吹仪(QGC-24T)、安捷伦SPE固相萃取装置；LC-C18富集柱购于上海安谱公司(500 mg，3 mL)；岛津SHMADZU高效液相色谱仪配紫外检测器(SPD-20A)；色谱分析柱为岛津ODS-P柱(250 mm×4.6 mm，5 μm).
2.2 实验装置自制外照式反应装置如图 1所示.所有实验开始前均将光源打开预热20 min使其达到稳定状态.紫外光源为汞灯，辐射波长分别为长波(UVA)、中波(UVB)和短波(UVC)；300 W氙灯加420 nm截止型滤光片(λ＞420 nm)作为可见光源，通过调节汞灯数量及光源与液面距离控制光强.反应容器为夹层烧杯，外接循环水冷却，使用恒温磁力搅拌器使溶液混合均匀.整个实验装置放于封闭式暗箱中，内部贴锡箔纸反光，外罩不透光黑布，暗箱前端开口，便于取样.
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| 图 1 外照式反应装置示意图(1. 光源; 2. 滤光片; 3. 烧杯; 4. 进水口; 5. 磁力搅拌器; 6. 出水口; 7. NOD溶液; 8. 搅拌子) Fig. 1 Schematic diagram of experimental apparatus |
配制初始浓度为100 μg·L-1的NOD溶液，设置暗反应(Dark)、TiO2暗反应(Dark/TiO2)、可见光(VIS)、可见光+ TiO2(VIS/TiO2)、UVA、UVB及UVC 7个不同光源条件.控制反应条件如下：TiO2用量为0.2 g·L-1，UVA光源光强为1428 μW·cm-2，UVB光源光强为810 μW·cm-2，UVC光源光强为126 μW·cm-2，可见光强为7880 lx，pH值为7.00±0.25，水温为(20.0±0.8)℃，分别在1、3、5、10、20、30、60、90、120、180、240 min取样，经固相萃取后以高效液相色谱法测定NOD含量，每组实验均重复3次，选择最佳光源条件进行后续实验.
2.3.2 UVC去除NOD的条件探索1) 单因素实验
以NOD初始浓度100 μg·L-1，光强126 μW·cm-2，pH值7.00±0.25，水温(20.0±0.8)℃为实验对照条件，选择温度(15、20、25、30 ℃)、NOD初始浓度(50、100、200、300 μg·L-1)、pH(3.0、5.0、7.0、9.0、11.0)、光强(48、81、126、225、318、384 μW·cm-2)4个因子，配制一定初始浓度的NOD溶液，分别在1、3、5、10、20、30、60、90、120 min取样，按2.3.3节和2.3.4节所述方法测定样品中NOD含量，确定最佳单因子工艺条件.每组实验均重复进行3次.
2) UVC光解最优工艺组合实验
根据单因素试验结果，固定pH为7，NOD初始浓度为100 μg·L-1，选择对UVC去除NOD影响较大的3个因素：温度、反应时间和光强，设置3因素4水平L(43)正交试验，按2.3.3节和2.3.4节所述方法测定样品中NOD含量，确定各组去除效率，选择最优工艺组合进行重复实验，确定其运行稳定性.正交设计表如表 1所示.
| 表 1 正交实验设计表 Table 1 Orthogonal table |
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在相应时间点取样10 mL，用C18固相萃取柱进行富集，具体步骤如下：①活化柱子：用5 mL甲醇分两次预洗C18柱，之后用5 mL水分两次活化C18柱，活化过程不要让柱子流干；②富集样品：未添加催化剂的样品直接上C18柱进行富集，添加过催化剂的样品先在4 ℃、8000 r·min-1条件下离心10 min，取上清液，重复3次后过0.45 μm有机系滤膜上C18柱进行富集，富集过程中流速不宜过快，以免影响回收率；③淋洗柱子：样品过柱完成后用5 mL 10%的甲醇分两次淋洗C18柱，最后使柱中液体完全流干；④洗脱柱子：淋洗完成后用5 mL 90%的甲醇(含0.1% TFA)分两次洗脱C18柱，收集洗脱液；⑤氮吹浓缩：将得到的洗脱液用氮气吹干仪在40 ℃条件下吹至近干，再用甲醇定容至0.5 mL，用1 mL注射器将以上浓缩液通过0.45 μm有机系滤膜转移至1 mL安捷伦进样瓶，待测.
2.3.4 NOD测定方法使用高效液相色谱法(HPLC)测定溶液中NOD含量，具体色谱条件如下：进样量20 μL，流动相为甲醇∶水(含0.1%TFA)=58∶42(V/V)，流速1.0 mL·min-1，检测温度为30 ℃，紫外检测波长为238 nm.
2.4 数据处理使用Excel 2010软件进行数据的计算和处理；利用Origin 进行作图分析；用SPSS 17.0对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并使用最小极差法(LSD)进行显著性分析，p<0.05表示有显著差异，p<0.01表示有极显著差异.
3 实验结果(Results) 3.1 不同光源对NOD去除效果的影响由图 2可知，NOD浓度在暗反应条件下几乎不发生变化，而可见光对NOD的去除效果较差，NOD浓度4 h内仅下降6%；TiO2/Dark体系和TiO2/VIS体系则分别证实了TiO2对NOD的吸附效果及其在可见光照射下的光催化能力，结果表明，暗处搅拌4 h后，TiO2对NOD的吸附基本达到平衡，此时NOD浓度大约降低了10%，而TiO2可见光催化反应对NOD的去除率不足14%，仅略高于吸附作用.不同波段紫外光对NOD有不同的去除效果，反应4 h后，UVA光源对NOD的去除率不足10%，UVB光源对NOD的去除率约为20%，UVC光源对NOD的去除率超过99%，NOD残留浓度低于世界卫生组织(WHO)及我国规定的饮用水中藻毒素的含量标准(微囊藻毒素MC-LR≤1.0 μg·L-1，目前国内外均无NOD饮用水含量标准，本研究参考微囊藻毒素标准(GB5749—2006)(中华人民共和国卫生部等，2006；WHO，2011)).综上所述，后续实验选择以UVC低压汞灯为光源，进一步探究光解NOD的最佳条件.
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| 图 2 不同光源对NOD去除效果的影响 Fig. 2 Effect of different light sources on NOD photolysis |
图 3为不同初始浓度NOD UVC光解去除率随时间的变化.初期UVC对4种初始浓度NOD的去除速率均较快；10 min后开始出现明显差别，此时初始浓度为50 μg·L-1的NOD去除率超过70%，而初始浓度为300 μg·L-1的NOD去除率仅50%；120 min后，初始浓度为50 μg·L-1的NOD去除率超过98%，低于饮用水中藻毒素限值，而初始浓度为100、200和300 μg·L-1的NOD去除率则分别为95%、91%和86%，随初始浓度升高而降低，且彼此之间差异明显.
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| 图 3 NOD初始浓度对UVC光解效果的影响 Fig. 3 Effect of different initial concentration on NOD photolysis |
对NOD浓度随时间的变化进行动力学拟合，结果表明，NOD浓度的倒数(1/C)与时间(t)呈良好线性关系，符合二级动力学拟合，4个方程可决系数R2均在0.94以上(表 2).随着NOD初始浓度由50 μg·L-1升高至300 μg·L-1，反应速率常数由5.3978 μg-1·L·min-1降低至0.1914 μg-1·L·min-1，半衰期则由3.71 min升高至17.42 min.由此可知，NOD初始浓度对UVC光解有显著作用，随着NOD初始浓度的增加，光解速率随之降低.
| 表 2 不同初始浓度NOD的反应动力学参数 Table 2 Kinetic parameters for NOD photolysis under different initial concentrations |
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| 图 4 温度对UVC去除NOD的影响(有相同字母表示组间差异不显著(p>0.05)，无相同字母表示组间差异显著(p<0.05)，下同) Fig. 4 Temperature effect on NOD photolysis(The same letter represents no significant difference between the groups(p>0.05)，the different letter represents significant difference between the groups(p<0.05)，the same as the following) |
图 4为4种不同温度下NOD浓度随时间的变化，由图可知，随温度升高，NOD去除率缓慢增大，但彼此之间差异不大，仅在20、30和120 min时15及30 ℃样品之间出现显著差异(p值分别为0.038、0.025和0.043，均小于0.05).光照120 min后，15、20、25和30 ℃样品的去除率分别为93.25%、94.21%、94.68%和95.56%，均保持较高水平.
与NOD初始浓度类似，不同温度下的UVC光解过程与二级动力学方程拟合性较好.如表 3所示，4种温度下的反应速率常数和半衰期较为接近，表现出随温度升高而缓慢变化的趋势.当反应温度由15 ℃升高到30 ℃，反应速率常数由1.1555 μg-1·L·min-1提高到1.6646 μg-1·L·min-1，半衰期则由8.65 min减少到6.00 min.
| 表 3 不同温度下的反应动力学参数 Table 3 Reaction kinetic parameters under different temperature |
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如图 5及表 4所示，相对于强酸性及碱性环境，中性及偏酸性条件下NOD去除率及反应速率常数略有升高，但仅在10 min时出现显著差异(p<0.05)，其余时刻组间并无显著差异(p>0.05).无论何种pH条件下，NOD去除率均保持较高水平，反应120 min后，其最终去除率均在90%以上.
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| 图 5 pH对UVC去除NOD的影响 Fig. 5 pH effect on NOD photolysis under UVC illumination |
| 表 4 不同pH的反应动力学参数 Table 4 Reaction kinetic parameters under different pH |
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如图 6所示，随光强的增大，UVC对NOD的去除效率迅速升高，组间差异明显，当光强为48、81、126、225和318 μW·cm-2时，反应10 min后，去除率分别为51.16%、62.43%、71.97%、80.51%和91.50%;120 min后，去除率则分别上升至88.62%、91.38%、95.02%、97.54%和99.07%.当继续增大光强至384 μW·cm-2时，NOD去除效率不再快速升高，120 min后NOD去除率为99.42%，和光强为318 μW·cm-2时相似.
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| 图 6 光强对UVC去除NOD的影响 Fig. 6 Effect of light intensity on NOD photolysis |
不同光强下，NOD的紫外光解二级动力学方程如表 5所示，随光强增大，反应速率常数持续快速升高，当光强由48 μW·cm-2升高到384 μW·cm-2时，反应速率常数由0.6177 μg-1·L·min-1增长到11.523 μg-1·L·min-1，反应半衰期则由16.19 min迅速减少至0.87 min.比较光强为318 μW·cm-2和384 μW·cm-2时的反应方程，后者反应速率常数虽大，但反应半衰期只比前者快了0.42 min，二者反应过程较为相似.
| 表 5 不同光强的反应动力学参数 Table 5 Reaction kinetic parameters under different light intensity |
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UVC光解最优工艺组合实验结果如表 6所示.3种因素对UVC光解NOD的影响程度由大到小分别为光强>反应时间>温度，最佳组合为温度30 ℃，光强318 μW·cm-2，反应时间4 h，此时NOD去除率达到99.60%，基本被完全去除，残留浓度低于WHO规定的藻毒素含量标准.
| 表 6 UVC光解最优工艺组合实验结果 Table 6 The optimization results for UVC photolysis |
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物质吸收光子能量，自身键能减弱，化学键断裂生成小分子中间产物，进而被自由基氧化成CO2、H2O等小分子及离子的过程称为光降解.光源是影响光解作用的最重要因素，通常情况下，光源波长越短，光量子的能量越大，光激发产生的强氧化自由基越多，对有机物的光解作用越强；此外，有机物分子中的不饱和结构最容易吸收光子能量发生断裂，当光源波长最接近其最大吸收波长时，光解效果越好(陈晓国等，2004).节球藻毒素(NOD)结构中的Adda毒性基团包含一个不饱和共轭双键，其最大吸收波长为238 nm，因此，可见光(λ＞420 nm)、UVA(320~420 nm)和UVB(320~400 nm)对NOD的光解作用远远比不上低压汞灯(UVC，主要发射波长254 nm).加入催化剂可以大大增加光解效率，TiO2是目前较为常用的光解催化剂，但本实验中TiO2与可见光的组合对NOD的去除效果很差，其原因在于，光催化剂TiO2主要受到波长小于或等于387 nm的紫外光激发产生自由基，而可见光对其没有激发作用(Nakata et al.，2012）).
光解反应初期，NOD去除速率较快，之后则呈现平稳趋势，推测可能是因为在反应初期，NOD在自由基的氧化作用下被迅速分解为中间产物，中间产物的增加争夺了自由基的氧化作用，随着反应时间的延长，NOD向中间产物的转化达到平衡，此时整个体系的反应侧重于中间产物的进一步分解，因此，NOD的去除速率明显降低(李伟英等，2010).虽然目前对NOD光解中间产物的研究较少，但由于NOD与微囊藻毒素具有结构上的相似性，因此，可参考微囊藻毒素的光解中间产物研究结果论证以上说法.研究表明，微囊藻毒素在UVC下的去除过程主要是通过Adda途径实现的，氧化自由基能够攻击微囊藻毒素毒性作用基团Adda侧链共轭双键及所属氨基酸，使其双键加成脱出并导致肽链的断裂，Adda基团开环后会重新整合成环状物质，这些环状物质在光照的持续作用下最终被矿化成CO2、水等无机物(程子波，2009；杨静等，2010).对光解微囊藻毒素的过程进行动态监测分析后发现，微囊藻毒素在UVC的照射下浓度迅速减小，之后趋于稳定，而光解过程中形成的主要中间产物的浓度则都呈现出先增加后减少的趋势(陈伟等，2004).根据光解藻毒素的反应机制可知，自由基对有机物分子的氧化作用是影响光解速率的关键因素，随着NOD初始浓度的升高，其单位可利用自由基的数量下降，因此，光解速率也随之下降.溶液温度的升高则会加快分子之间的热运动，加速粒子之间的碰撞，加快光解过程.泡沫节球藻水华通常发生在夏季(7—8月)，此时水温较高(30 ℃左右)，与实验温度相似，因此，在水华爆发时利用自然条件加UVC光照即可快速去除水体中NOD.溶液pH能够影响自由基的构型从而影响光解速率，中性及偏酸性环境有利于·OH强氧化自由基的存在，而碱性条件则倾向于形成·HO2自由基，其氧化能力差于·OH，因此，中性及偏酸性环境较有利于UVC对NOD的光解(Bin et al.，2001）;李伟英等，2010).从本实验的结果来看，虽然中性及偏酸性环境下的NOD去除率略高于强酸性和碱性环境，但彼此之间并不存在显著差异，可能的原因是较强的光照条件会产生大量的强氧化自由基，环境pH的变化并不足以改变所有自由基的存在形式，因此，在不同的pH条件下，NOD的去除率均保持较高水平.就光强而言，光强越大，NOD可利用的强氧化自由基数量越多，光解速率就越快.但单位NOD分子可利用的氧化自由基数量存在一个饱和值，当达到这个饱和值后，即使再增大光强也不能加快NOD的紫外光解速率.
UVC光降解对节球藻毒素处理效率高，设备易搭建，是一种非常理想的藻毒素去除方法.本实验利用自制的小型装置探究了实验室条件下光解节球藻毒素的效果及影响因素，后续研究应倾向于大型紫外光解设备的研发及其在实际运用中的处理效果.同时，由于紫外光仅占太阳光谱的少部分，而太阳光的大部分能量集中于可见光部分，因此，如何催化利用可见光性能从而降低反应能耗也是今后的研究重点之一.
5 结论(Conclusions)1) 暗反应、可见光、可见光+TiO2的组合、UVA和UVB均对NOD无明显去除作用，最高去除率约为20%；UVC处理则可以快速去除水中NOD，使其达到WHO及我国规定的饮用水中藻毒素含量限值.
2) NOD初始浓度对UVC光解作用有较大影响，随NOD初始浓度升高，去除率降低；光强对UVC去除NOD有显著影响，随光强增大，NOD去除率快速升高，当光强增大至一定值时，NOD去除率保持稳定；温度和pH对UVC光解NOD无显著影响.
3) UVC去除NOD过程符合二级反应动力学，R2均在0.94以上，拟合结果良好.
4) 单因素对UVC去除NOD的影响程度由大到小分别为光强＞时间＞温度，最佳反应条件组合为温度30 ℃，光强318 μW·cm-2，pH=7，反应时间4 h，此时初始浓度为0.1 μg·mL-1的NOD几乎被完全去除，去除率超过99%.
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