邻苯二甲酸酯(Phthalate esters，PAEs)和磷系阻燃剂(Phosphorus flame retardants，PFRs)作为增塑剂和阻燃剂被添加于聚乙烯地板、家具、电器和个人护理品等日常用品中(Rudel et al.，2003).通常PAEs和PFRs并未与产品发生化学键合，在日常使用中通过磨损或挥发而缓慢进入室内环境，因此，在室内灰尘中被频繁检出.一些研究中发现，室内灰尘中PAEs的含量高达295 μg·g^-1(Guo et al.，2011)，而PFRs的含量达到128 μg·g^-1(Cao et al.，2014).

无意识的室内灰尘吞食是人们摄入PAE和PFRs的主要途径，尤其对于手口频繁接触的婴幼儿更为重要(Bornehag et al.，2004; Meeker et al.，2010).传统的风险评价多基于灰尘中污染物的总量.然而灰尘中的有机污染物经吞食进入人体后，会在人体胃肠液相与灰尘相之间发生分配作用.在此过程中，通常只有部分有机污染物溶解在胃肠液中，这部分被认为是可能被人体吸收，即生物有效态的部分.因此，仅以污染物总量为基准会高估健康风险，而测定灰尘中有机污染物的生物有效性对评价其暴露风险至关重要.体外胃肠模拟法利用人工配制的消化液，模拟人体的胃和肠的消化过程来测定污染物的生物有效性(Bioaccessibility).其中，生理原理提取法(Physiologically based extraction test，PBET)已被广泛用于各类有机污染物的生物有效性测定.例如，Tang等(2007)采用该方法研究了土壤样品中多环芳烃(PAHs)的生物有效性，并根据生物有效性结果进行了人体摄入风险评估.Smith等(2012)也采用该方法测定了污染土壤中DDT的生物有效性.

诸多研究表明，模拟液的生理参数及操作条件的改变会对生物有效性的测定结果造成显著影响.例如，徐瑾等(2011)采用静态SHIME法研究发现，肠液pH呈中性时多氯联苯(PCBs)的生物有效性显著高于酸性条件，生物有效性随着消化时间的延长和液固比的增加而增大，但当消化时间长于6 h及液固比大于50以后，生物有效性的变化不再显著.杨彦等(2014)则采用PBET法研究发现，人体经口摄入PAEs剂量为10 μg·g^-1、基质质量为0.4 g、pH值为7时PAEs生物有效性最高.到目前为止，采用PBET方法探究灰尘中PAEs及PFRs生物有效性影响因素的研究较少.考虑到人体肠液的pH与胆盐含量会随着人体摄食状态的变化而改变，摄入灰尘的量也与人体暴露风险直接相关.因此，本研究以PBET体外模拟法为基础，探究肠液中胆盐含量、肠液pH值及固液比对室内灰尘中PAEs和PFRs的生物有效性的影响.同时，考虑到婴幼儿更易吞食灰尘，本文也将研究摄入婴儿食物——奶粉对PAEs和PFRs的生物有效性造成的影响.

邻苯二甲酸二正丁酯(Dibutyl phthalate，DBP)、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(Di(2-ethylhexyl)phthalate，DEHP)、邻苯二甲酸丁基苄基酯(Butyl benzyl phthalate，BBP)和三(2-氯乙基)磷酸酯(Tris(2-chloroethyl)phosphate，TCEP)，购自阿拉丁试剂(上海)有限公司和上海百灵威科技有限公司.奶粉购自美国超市(柯克兰婴儿含铁配方).

胃液：取1000 mL纯水，加入苹果酸钠0.5 g，柠檬酸钠0.5 g，猪胃蛋白酶1.25 g，乳酸420 μL，冰醋酸500 μL，用盐酸调pH至2.5.

室内灰尘样品取自中国南京市某公寓，通过吸尘器(Philips Fc8222，China)将灰尘从地面收集到纸袋中.灰尘样品冷冻干燥后过150 μm的尼龙筛，收集粒径小于150 μm的灰尘颗粒.灰尘样品置于清洁铝箔中，-20 ℃保存备用.

称取0.2 g灰尘样品于玻璃离心管中，加入20 mL正己烷，于超声仪中超声30 min后，在3000 r·min^-1下离心5 min，上清液由无水硫酸钠过滤脱水入150 mL圆底烧瓶中，该过程重复3次.经旋蒸仪浓缩至干燥，再用2 mL正己烷溶解，经0.45 mm尼龙滤头过滤入2 mL测样瓶，-20 ℃保存至测样.

参考Ruby等(2002)和Tilston等(2011)文献，本文采用稍做修改的PBET法测定灰尘样品中PAEs和PFRs的生物有效性.称取0.2 g灰尘样品于玻璃离心管中，加入20 mL胃液，37 ℃、150 r·min^-1下恒温振荡1 h；之后再加入牛胆汁胆盐0.036 g、猪胰酶0.01 g，用NaOH调节pH至7.0，开始肠阶段的提取；在37 ℃、150 r·min^-1下恒温振荡4 h后，取溶液在3000 r·min^-1下离心5 min，上清液过0.45 mm聚四氟乙烯(Polytetrafluoroethylene，PTFE)滤膜入玻璃离心管.用移液管于玻璃离心管中移取10 mL溶液，用10 mL正己烷于超声仪中超声30 min(重复萃取3次)，正己烷层由无水硫酸钠脱水过滤入150 mL圆底烧瓶中.合并3次提取液，用旋蒸仪将溶液浓缩后重新用2 mL正己烷溶解，将溶液用0.45 mm尼龙滤头过滤入2 mL测样瓶，-20 ℃保存至测样.

SB-800 DTD超声波振荡器、德国IKARV10旋转蒸发仪、HZP-250恒温振荡培养箱、GC-MS(7890/5975，安捷伦科技(中国)有限公司).

色谱柱：TR-5MS(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)；载气：氦气(纯度>99.999%)；柱流量：1 mL·min^-1；进样口温度：280 ℃；程序升温如下：

PAEs：70 ℃保持2 min，以10 ℃·min^-1的速度升温至135 ℃，以3 ℃·min^-1的速度升温至160 ℃，以1 ℃·min^-1的速度升温至175 ℃，以3 ℃·min^-1的速度升温至195 ℃，最后以10 ℃·min^-1的速度升温至300 ℃并保持10 min.

PFRs：60 ℃保持2 min，以20 ℃·min^-1的速度升温至170 ℃，以4 ℃·min^-1的速度升温至200 ℃，以20 ℃·min^-1的速度升温至220 ℃，最后以4 ℃·min^-1的速度升温至270 ℃.

离子源温度：280 ℃；采集方式：提取离子(SIM).特征离子：DBP(149，84，76，223)；DEHP(149，167，279)；BBP(149，91，206)；TCEP(248.98，250.97).

根据文献(Xing et al.，2008)，污染物的生物有效性的计算公式如下：

式中，B为污染物的生物有效性；C_模拟液为污染物从基质中释放到胃肠模拟液中的浓度(mg·L^-1)；C_总量为基质中污染物的总浓度(mg·L^-1).

为了避免交叉污染，在实验过程中均使用玻璃器皿，并在使用之前放置在450 ℃的马弗炉里高温烘烤4 h.方法空白、实验空白及试剂空白均包括在质量控制中，GC-MS分析检测时，每隔8个样品检验一次试剂空白.TCEP、BBP在试剂空白中没有检出，DBP、DEHP均有检出，平均浓度分别为16.9和64.4 μg·L^-1，该浓度在计算时进行扣除.对于GC-MS，连续测量7个空白试剂，以平均的背景噪音值的3倍为仪器检出限.该仪器对TCEP、DBP、BBP和DEHP的检出限分别为2.9、3.0、11.2和13.4 μg·kg^-1.以氘代磷酸三丁酯为内标测得的总量提取、胃肠模拟提取及添加奶粉后的胃肠模拟提取的回收率分别是98.2%±8.15%、84.9%±14.1%和78.4%±8.37%.

实验中选取的室内灰尘的有机碳总量为17.3%，粒径为19.3 μm.在灰尘中污染物的总量中，DEHP的含量最高，为259 mg·kg^-1，这与其在日常用品中广泛使用有关，据统计，全球每年DEHP的产量高达200万t(Guo et al.，2011)；其次为DBP，含量为8.1 mg·kg^-1，DBP被广泛应用于个人护理品、化妆品和药物涂层(Gevao et al.，2013；Wang et al.，2013)；BBP含量最低，为0.59 mg·kg^-1；磷系阻燃剂TCEP的含量为9.6 mg·kg^-1，略高于Cao等(2014)在北京室内办公室灰尘中检测出的含量(5.61 mg·kg^-1)，可能是由于相对于办公室布置，家庭中室内装饰物较多造成的.Stapleton等(2009)研究发现，室内装饰物和沙发、椅子等聚氨酯(PU)家具中的TCEP是室内灰尘中TCEP的主要来源.

图 1为PBET法测定的污染物生物有效性.由图 1可知，磷系阻燃剂TCEP的生物有效性最高，为52%；邻苯二甲酸酯中，DBP的生物有效性相对较高，为6.5%；而DEHP、BBP的生物有效性分别仅为1.9%和1.5%.污染物的生物有效性与其辛醇-水分配系数有关.如图 1所示，PAEs和PFRs的生物有效性随logK_ow的增大而减小.这种随logK_ow增大，生物有效性逐渐减小的现象在其他类型的有机污染物中也被报道.例如，Tang等(2006)和Kang等(2011)研究发现，PAHs的生物有效性随logK_ow的增大而减小.Smith等(2012)和Juhasz等(2014)认为在体外胃肠模拟试验中，没有足够的亲脂性物质提供足够的吸附力使有机污染物由固体颗粒释放到胃肠模拟液中，尤其是对溶解度较小的疏水性有机物更为明显.这也是导致有机污染物生物有效性随logK_ow的增大而减小的主要原因.

图 1(Figure 1)

图 1 PAEs和PFR的生物有效性与logKow的关系 Fig. 1 Relationship between logKow and the bioaccessibility of PAEs and PFR

由于个体差异，摄食后体内分泌的胆盐含量会有所不同.本实验通过改变PBET方法中肠液(体积为20 mL)胆盐的含量(0.036、0.10、0.15、0.20和0.30 g)，研究不同胆盐质量对生物有效性的影响.由图 2可知，DBP、BBP和DEHP的生物有效性随胆盐浓度增加而显著增加(p<0.05)，而当胆盐质量升至0.20 g(浓度为10 g·L^-1)以后，胆盐的浓度对生物有效性的影响并不显著(p>0.05).胆盐是由肝细胞分泌的胆汁中初级胆汁酸(包括胆酸、鹅脱氧胆酸及其与甘氨酸或牛磺酸的结合产物)与次级胆汁酸(主要包括脱氧胆酸、石胆酸及其在肝中分别与甘氨酸或牛磺酸结合生成的结合产物)形成的钠盐或钾盐，称为胆汁酸盐(巩利昌等，2014).由于胆汁酸分子含有亲水性的羟基和羧基，又含有疏水性的甲基和烃核，胆盐可以降低水/油两相的表面张力，使脂肪形成微滴，分散于水溶液中(侯万儒，1990).临界胶束浓度(CMC)的概念曾用于解释胆汁浓度对多环芳烃(PAHs)迁移的影响.有研究表明，胆汁中的胆盐胶束会在自身内部形成一个非极性的环境，从而增加疏水性化合物的溶解度(Oomen et al.，2004).当胆汁浓度高于CMC(0.15 g·L^-1)时，胆盐能减少模拟液的表面张力(Tang et al.，2006).Wright等(2008)的研究也发现，增加胆盐浓度可促进类胡萝卜素的转移.但并非肠消化阶段胆盐浓度越高有机污染物的生物有效性越大，因为当酶的作用面积达到饱和以后，再添加胆盐并不能再降低其表面张力，增加酶的作用面积以促进其水解(Wright et al.，2008).所以当胆盐质量大于0.20 g(10 g·L^-1)以后，DBP、BBP和DEHP的生物有效性没有显著提高.此外，肠消化阶段胆盐浓度的改变对于TCEP的

图 2(Figure 2)

图 2 胆盐含量对DBP、DEHP、BBP和TCEP生物有效性的影响(不同字母代表显著性差异,p<0.05) Fig. 2 Influence of bile contents on the bioaccessibility of DBP, DEHP, BBP and TCEP (different letters indicate significant difference, p<0.05)

生物有效性影响并不显著.由于TCEP的K_ow值较小，亲水性较强，而胆盐的存在有助于脂溶性物质的溶解，而对亲水性比较强的物质从介质中释放并无明显影响，因此，胆盐浓度的增加并没有显提高TCEP的生物有效性.

通常人体胃液的体积在10~100 mL之间，而摄入的灰尘量可能由于呼吸深浅、环境污染等明显不同.本实验维持模拟液体积(20 mL)不变，改变摄入灰尘的质量(0.4、0.2、0.13和0.1 g)来研究不同液固比(50∶1、100∶1、150∶1和200∶1，mL·g^-1)对污染物的生物有效性的影响.如图 3所示，随液固比的增加，DBP和DEHP的生物有效性呈上升趋势，当液固比达到150 mL·g^-1后趋于稳定.当模拟液体积逐渐增大时，灰尘与模拟液接触的面积逐渐增加，导致越来越多的DBP和DEHP释放到溶液中.当液固比大于150 mL·g^-1时，灰尘样品相对于模拟液较少，灰尘颗粒表面也已经与模拟液达到充分接触，使DBP和DEHP向溶液中的释放达到平衡.徐瑾等(2011)的研究也观察到了类似的现象：当液固比增加到50时，土壤中的PCBs向胃肠模拟液中的释放达到平衡.但由于徐瑾等(2011)采用的是土壤样品(过80目筛)，而本实验采用的是灰尘样品(过100目筛)，污染物向模拟液释放平衡时的液固比也会有所差异.本实验中TCEP的生物有效性受液固比的影响并不显著，这可能是由于TCEP的水溶性较大，容易由灰尘释放到模拟液中.因在灰尘样品中的含量较低，BBP的生物有效性测定时会有较大误差，也给比较分析带来了不确定性.

图 3(Figure 3)

图 3 胃肠模拟液/灰尘体积质量比对DBP、DEHP、BBP和TCEP生物有效性的影响(不同字母代表显著性差异,p<0.05) Fig. 3 Influence of liquid-to-solid ratios on the bioaccessibility of DBP, DEHP, BBP and TCEP (different letters indicate significant difference, p<0.05)

婴幼儿由于频繁的手口接触，更易吞食灰尘，且婴幼儿处于生长发育阶段，属于易受到污染物危害作用的敏感人群.因此，本文选择婴儿奶粉为典型婴幼儿食物，研究食物与灰尘共同摄入时对污染物生物有效性的影响.由图 4可知，在奶粉存在的情况下，灰尘中DBP、BBP、DEHP和TCEP的生物有效性与模拟液中不含奶粉时测得的结果相比均显著增加(p<0.05)，当奶粉增加到10~15 g·L^-1时，生物有效性达到最高值，而后趋于平稳或有下降的趋势.奶粉中的脂肪成分有助于灰尘中污染物的释放.Yu等(2010)发现，肉类食品中多溴联苯醚(PBDEs)的生物有效性与脂肪含量具有显著正相关.李俊岭等(2011)也发现样品中脂肪含量越高，PCBs的生物有效性越大.这可能是由于胆汁中的胆盐对脂肪具有乳化作用并且可以降低水/油两相的表面张力，增加了有机污染物的溶解度.随着奶粉在模拟液的浓度逐渐增高，模拟液中脂肪的含量也随之增高，导致了DBP、BBP、DEHP和TCEP的释放程度越来越高，生物有效性也就越大，增加了有机物的暴露风险.当模拟液中的奶粉浓度增加到一定值(10~15 g·L^-1)，模拟液中PAEs的逸度达到平衡时，模拟液中有限的胆盐对脂肪的乳化作用达到平衡.当奶粉含量继续增加时，在灰尘中DBP、BBP、DEHP和TCEP溶出的过程中，奶粉中多余的脂肪反而与污染物产生竞争作用，导致生物有效性呈现下降趋势.4种污染物中，DBP、DEHP和BBP的生物有效性受奶粉添加影响较大，最大值相对于没有添加奶粉时增加了4~7倍，而TCEP则只增加了2倍左右，这是由于TCEP的水溶性相对较强，从灰尘中溶于模拟液的能力相对较强，因此，受到奶粉的提升作用也相对较弱.

图 4(Figure 4)

图 4 奶粉浓度对DBP、DEHP、BBP和TCEP生物有效性的影响(不同字母代表显著性差异,p<0.05) Fig. 4 Influence of milk powder concentration on the bioaccessibility of DBP, DEHP, BBP and TCEP (different letters indicate significant difference, p<0.05)

在肠相消化过程中，消化液的pH会因为摄入食物种类/质量的不同而改变，探究pH对灰尘中有机物的生物有效性的影响具有实际意义.本文研究结果发现，肠消化阶段的pH在6.0~8.0的范围内，对于有机污染物DBP、DEHP、BBP和TCEP的生物有效性的影响并不显著(图 5，p>0.05).此外，肠消化阶段结束后测定的溶液pH值由原来的6.0和6.5分别上升至6.12和6.62，pH值为7.5和8.0的溶液则降至7.23和7.40，而pH值为7.0的溶液变化不大.可以看出，室内灰尘在胃肠模拟液中可能起到一定的缓冲作用，这种作用将pH维持在中性，从而缓解了pH对有机污染物生物有效性的影响.pH通常会通过影响胆盐的溶解度从而影响溶液中有机物的释放.Wright等(2008)认为，pH低于4.0时60%的胆盐会形成胶束沉淀，进而减少灰尘中有机物的释放；随着pH的提高，胆盐逐渐溶解，从而增加了有机物从灰尘中的释放，并在pH=8时趋于稳定.本实验中肠液pH范围为6.0~8.0，在此区间内胆盐的溶解度未受明显影响，导致pH变化对生物有效性的影响并不显著.

图 5(Figure 5)

图 5 肠液pH对DBP、DEHP、BBP和TCEP生物有效性的影响(不同字母代表显著性差异,p<0.05) Fig. 5 Influence of pH in intestinal solution on the bioaccessibility of DBP, DEHP, BBP and TCEP (different letters indicate significant difference, p<0.05)

本实验采用PBET法测定室内灰尘中PAE和PFR的生物有效性，研究了胆盐浓度、液固比、奶粉添加和肠液pH对灰尘中PAE和PFR的生物有效性的影响，结果表明：

1)DBP、BBP和DEHP的生物有效性随胆盐浓度的增加而上升，当胆盐浓度上升至10 g·L^-1后，生物有效性开始趋于稳定.对于水溶性较大的TCEP，胆盐浓度的增加对其生物有效性没有显著影响.

2)随液固比的增加，DBP、DEHP的生物有效性显著上升.而TCEP由于其水溶性较强，液固比的增加没有提高其生物有效性.

3)在同时食用奶粉的情况下，DBP、BBP、DEHP和TCEP的生物有效性随着奶粉摄入量的增加而显著增加.当奶粉浓度增加到一定程度(10~15 g·L^-1)后，奶粉中的脂肪对灰尘中有机物的溶出可能呈现竞争作用，有机污染物的生物有效性呈现出下降趋势.

4)由于灰尘本身具有的缓冲能力，肠消化阶段pH的变化(pH=6~8)对有机污染物DBP、DEHP、BBP和TCEP的生物有效性的影响并不显著.

4种因素对PBET方法测得的有机物生物有效性的影响趋势有所不同，但又互相联系.因此，亟需进行体内暴露实验的研究，以便确定最佳的体外模拟方法.胃肠模拟体外法没有考虑到污染物进入人体后的内暴露过程，可能与动物活体实验结果有所偏差.本文的目标物PAE和PFR在动物体中易被代谢，分析检测方面有很多困难，并且生理参数的变化(如摄食量不同，与食物(如奶粉)一同摄入引起肠道胆盐含量和pH的变化等)，导致污染物的代谢途径也会发生相应变化，因此，本文的研究结果可以为得到准确的体内数据提供前期理论参考.在后续的研究中，建议采用同位素标记和LC-QTOF-MS结合手段鉴定该两类污染物在动物体内的代谢产物，明确代谢累积过程，计算体内生物有效性，并以此为基准，发展建立适合评价灰尘中邻苯二甲酸酯与磷系阻燃剂生物有效性的体外方法.