极端环境微生物是目前国内外学者关注的热点.低温菌是极端微生物之一,并根据其生长温度特性分为嗜冷菌(Psychrophilies)和耐冷菌(Psychrotrophs)两类(Margesin et al., 2001).在寒冷环境中,这类微生物仍能通过对自身细胞膜、蛋白酶的调整或合成冷冻保护剂等来适应低温的影响,以一定的速率繁殖、生长和活动(张远,2014；唐双等,2015).2000年Chevalier 成功地从南极和北极分离到 4 株耐冷的丝状蓝细菌(Cyanobacteria),该菌在低温环境条件下对氮和磷有较高的去除率,从而为低温环境下污水中氮磷等污染物的去除提供了新的思路(Chevalier et al., 2000).在所有的气候条件中,有机污染问题普遍存在,而在寒冷的环境中,温度对生物处理过程影响颇大(van den Brand et al., 2014),各类低温微生物在生物降解过程中发挥越来越显著的作用,如低温酵母在低温条件下对广泛碳氢化合物的降解(Margesin,2014).在我国北方地区冬季漫长、气温低,微生物活性降低,污水的生物处理效果难以保证,而将低温菌应用到污水处理中,出水的各水质指标都得到了良好的去除效果.但由于直接投放菌体不仅成本高,还会造成大量菌体流失,难以控制它长期的处理效果,因此,找到一种成本低处理效果又好的方法极为重要.

固定化生物技术是从20世纪60年代开始迅速发展起来的一项新技术,它是通过化学或物理的手段将游离的细胞或酶定位于限定的空间区域内避免菌体或酶大量流失,使其保持活性并能够反复利用的方法(王洪祚等,1997).在污水处理中,固定化后微生物密度大,抗冲击负荷能力强,作用时间长,固液分离效果好,并且可以选择优势菌株进行专门利用,定向处理效果好(吴伟,2011；章霞等,2015).对于固定化技术理论及实际应用,在诸多废水处理研究中已经体现出非常大的优势(Cruz et al., 2013；Reungsang et al., 2013；胡自伟等,2002；姜安玺等,2003；马立等,2005；张雷等；2007),并且针对在低温条件下固定化微生物处理污水也有所探索(Wang et al., 2015).将固定化技术强化应用在SBR工艺流程中进行污水处理将更加优化污水处理的效率及去除某些特定难降解的污染物(郭静波等,2013；王亚娥等,2009；何旭辉,2006).而本实验采用的固定化菌株是由南四湖底泥中分离纯化出经鉴定为黄假单胞菌属(Pseudomonas flava),并命名为Pseudomonas flava WD-3的低温菌,已确定能高效去除合成污水中的COD、总氮、总磷,其去除率可分别达到62.92%、56.42%、50.63%(唐美珍等,2013),并在低温条件下应用于人工湿地,对污水取得了良好的处理效果(Tang et al., 2015).而直接投加菌体,难以观测菌体去向和流失程度,并且不能够实现重复使用.因此,本实验采用海藻酸钠(SA)包埋法及海藻酸钠(SA)加聚乙烯醇(PVA)包埋法对该类菌株进行固定化,得出其最优条件并加以模拟实际应用,投加到SBR废水处理工艺流程中处理城市生活污水.同时,研究不同投加量与不同水力停留时间(HRT)对污染物去除效率的影响,并对其在SBR工艺流程应用中对污水中各个污染物的降解效率进行降解一级动力学模型模拟(唐美珍等,2014).本实验是对该低温菌株应用于城市生活污水处理的继续探索,其实验结果定将为北方寒冷地区冬季废水处理提供有力的理论基础和技术支持,对水资源的再利用有着十分重要的意义.

实验菌株：菌株Pseudomonas flava WD-3 是冬季从南四湖人工湿地的底泥中培养、分离、筛选出来,经鉴定为黄假单胞菌(Pseudomonas flava),命名为Pseudomonas flava WD-3,基因登陆号为JX114950(唐美珍等,2013).挑取斜面保存的菌株于富集培养基中活化48 h,然后在4 ℃、1200 r·min^-1下离心,收集菌体细胞,取湿菌体细胞再悬浮于无菌水中,制备成菌悬液(李明堂等,2012),在600 nm波长下,测定吸光度在1.2~1.6范围内,细菌个数约为4.575×10⁸个·mL^-1.

模拟废水：模拟废水以葡萄糖为碳源、氯化铵为氮源、磷酸二氢钠为磷源,并添加适量的微量元素,使C∶N∶P=100∶5∶1,COD、总氮、总磷、氨氮的初始值分别约为1000、50、10、15 mg·mL^-1,pH=7.0.

生活污水：采用从曲阜市生活污水处理厂取回的新鲜污水,测定其初始COD、氨氮、总磷、总氮分别为217.8~310.2、15.9~18.2、11.1~15.3、50.2~60.1 mg·mL^-1.

Pseudomonas flava WD-3 固定化小球的制备方法见图 1.

图 1(Fig. 1)

图 1 固定化小球的制备流程 Fig. 1 The preparation process of immobilized pellets

设计一个四因素四水平正交试验,分别探索SA质量分数、PVA质量分数、固定化液质量分数及交联时间对处理效果的影响(武心华,2009).根据预实验结果设定正交试验中四水平的因子取值,选用正交表L16(44),以最终废水中4个指标氨氮、总磷、总氮、COD的去除率为指标,选定4个最优水平；4个因素分别是SA质量分数、PVA质量分数、固定化液质量分数及交联时间,各因素水平表见表 1.

表 1(Table 1)

表 1 正交试验因素水平表 Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

表 1 正交试验因素水平表 Table 1 Factors and levels of the orthogonal test 水平 海藻酸钠 SA质量分数 聚乙烯醇 PVA 质量分数 固定化液 CaCl2 质量分数 交联时 间/h 1 2% 4% 2% 8 2 3% 6% 3% 16 3 4% 8% 4% 24 4 5% 10% 5% 36

反应器为有机玻璃制成,形状为圆柱体,直径15 cm,高度25 cm,体积约为3 L,有效容积2 L；反应过程中采用机械搅拌,微孔曝气条充氧曝气,通过转子流量计调节曝气量来控制 DO 浓度；SBR 系统采用间歇进水、间歇排水方式,污泥浓度2500 mg·L^-1,实验装置的示意图见图 2,运行周期见表 2.

图 2(Fig. 2)

图 2 SBR试验装置示意图(1. 进水口, 2. 控制阀,3. 气泵,4. 取样口,5. 出水口,6. 曝气头,7. 搅拌棒,8. 搅拌器,9. 反应器,10. 填料) Fig. 2 The test installation diagram of SBR

表 2(Table 2)

表 2 SBR系统运行周期 Table 2 The operation parameter of SBR

表 2 SBR系统运行周期 Table 2 The operation parameter of SBR 实验编号 进水/min 搅拌/h 曝气/h 静置/min 出水/min 注：在2.5节实验中曝气时间均选择6 h，在2.6节实验中曝气时间遵从表2，其他参数一致. 1 2 0 0 55 3 2 2 1 2 55 3 3 2 1 4 55 3 4 2 1 6 55 3 5 2 1 8 55 3

确定该菌株的最佳固定化条件后,于2013年12月初开始运行SBR污水处理工艺,控制水温6~8 ℃,分别投加数量不等的固定化小球(含菌悬液5~20 mL,细菌个数约为4.575×10⁸个·mL^-1)于SBR工艺流程中,以未投加固定化小球的为对照组,连续运行3个月,测定水中NH₄⁺-N、TP、COD和TN 浓度变化情况.

通过2.5节中的实验,选择最佳的固定化小球投加量进行试验,设置不同的水力停留时间(HRT=0~10 h),以未投加固定化小球的SBR工艺流程为对照组.连续运行3个月,测定水中NH₄⁺-N、TP、COD和TN 浓度变化情况.

氨氮的测定采用纳氏试剂分光光度法,COD_Cr的测定采用重铬酸钾氧化法,总磷的测定采用钼酸铵分光光度法,总氮的测定采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法,各指标测定的具体操作步骤详见《水和废水监测分析方法(第4版)》.

正交试验的结果见表 3,比较每个因素的极值R,该值越大所对应的因素影响越大,即为主要因素.本研究中影响吸附率的因素从主到次依次为PVA质量分数>交联时间>SA质量分数>固定化液质量分数,即PVA的质量分数对固定化小球处理废水的效果影响最大；比较每个因素在不同水平下的平均值,数值越大,综合去除效率(结合4个水质指标的去除效率)越高.在本研究中,去除效率最好的水平组合为A₃B₂C₄D₃,即当SA质量分数取4%,PVA质量分数取6%,固定化液质量分数取5%,交联时间取24 h时,固定化小球对模拟废水中COD、总磷、氨氮、总氮的去除效率分别达到了69.79%、66.07%、57.54%、64.79%,虽然总氮的去除效率在各水平不是最高,但结合固定化小球的成球效果及各个物理指标,这是最优的一个固定化条件组合.并且Pseudomonas flava WD-3 游离状态对模拟污水中 COD、总磷、氨氮的去除率分别为62.92%、56.42%、50.63%(唐美珍等,2013),固定化后对模拟废水中COD、总磷、氨氮的去除效率分别是游离菌的1.11、1.17、1.14倍,表明该菌固定化后对污水各污染物的去除效率明显提高.

表 3(Table 3)

表 3 正交试验结果：各污染指标的去除效率和物理性能分析 Table 3 Analysis of the orthogonal date about the removal rates and physical properties

表 3 正交试验结果：各污染指标的去除效率和物理性能分析 Table 3 Analysis of the orthogonal date about the removal rates and physical properties 实验序号 各因素取值水平 COD 去除率 氨氮 去除率 总磷 去除率 总氮 去除率 成球效果 A B C D 注：表中A、B、C、D分别代表海藻酸钠(SA)、聚乙烯醇(PVA)、固定化液(CaCl2)的质量分数及交联时间4个因子. 1 1 1 1 1 28.79% 16.80% 35.63% 19.25% 成球易 强度差 传质性好 弹性差 易碎 2 1 2 2 2 48.10% 39.68% 50.33% 49.98% 成球易 强度差 传质性好 弹性一般 3 1 3 3 3 50.56% 39.10% 44.31% 66.72% 成球易 强度较好 传质性一般 4 1 4 4 4 38.75% 40.56% 37.98% 45.69% 成球易 强度好 传质性差 质地硬 5 2 1 2 3 49.56% 50.61% 41.93% 45.83% 成球易 强度差 传质性好 弹性差 6 2 2 1 4 39.56% 45.81% 35.53% 40.32% 成球易 强度较好 传质性好 弹性一般 7 2 3 4 2 47.12% 41.57% 59.56% 50.44% 成球易 强度好 传质性较好 弹性好 8 2 4 3 1 35.33% 39.98% 45.12% 43.46% 成球易 强度大 传质性一般 9 3 1 3 4 54.47% 46.72% 49.99% 42.70% 成球易 强度差 传质性好 弹性较差 10 3 2 4 3 69.79% 57.54% 66.07% 64.79% 成球易 强度较好 传质性一般 弹性差 11 3 3 2 2 59.98% 46.13% 41.14% 37.87% 成球易 强度好 传质性较好 12 3 4 1 1 50.08% 28.14% 45.62v 40.89% 成球易 强度大 传质性差 13 4 1 4 2 49.78% 39.78% 50.16% 47.73% 成球较难 粘度大 易拖尾 强度一般 14 4 2 3 1 39.43% 36.22% 29.09% 32.88% 成球较难 粘度大 强度较好 传质性一般 15 4 3 2 4 48.91% 40.62% 38.14% 39.99% 成球较难 粘度大 易拖尾 传质性较好 16 4 4 1 3 50.25% 37.54% 20.56% 42.41% 成球较难 强度大 易拖尾 传质性差 质地硬 均值1 40.14% 42.50% 42.07% 40.42% 均值2 45.75% 42.18% 42.19% 40.58% 均值3 43.23% 44.51% 44.74% 43.72% 均值4 40.22% 40.15% 43.44% 44.61% R 5.44 2.39 1.77 3.46

在正交试验中,各因素在不同水平下对固定化小球的物理性能和处理效果都有很大的影响,最优固定化小球如图 3所示.首先SA作为天然凝胶载体材料,在包裹菌体成球上发挥巨大作用,质量分数过低时,小球难以成形,成形后其强度差易碎,并且SA质量分数过低还影响小球对菌的包裹,造成菌体有少量流失,影响菌体对污水的处理效果,质量分数过高增大其成球难度,小球粘度大易拖尾,处理效率也会随之降低；其次PVA作为有机合成载体材料,其弹性较好但传质性较差(任静,2013； 段海明,2012),质量分数过低会导致小球抗压性不够影响处理效果,质量分数过高又会影响其传质性能,小球质地硬导致菌体活性受阻致处理效率降低,所以固定化小球对PVA的质量分数有较大的要求,其质量分数的变化对去除率有较大度的影响；而固定化时间对小球的外部形态影响不是很大,但其交联时间的长短直接决定小球的成形内部结构及状态,对废水处理效率有较大影响；通过实验发现,由于有机合成材料PVA的存在,制备复合载体材料的小球时对固定化液质量分数要求会变高,固定化液质量分数过低会使小球难以交联成形,质量分数过高又会使小球质地过硬,传质性变差,自然降低对污水的处理效率.

图 3(Fig. 3)

图 3 固定化小球成型图片 Fig. 3 The picture of the molding of about immobilized bacteria

连续运行3个月,控制水温为6~8 ℃,不同固定化小球的投加量对SBR工艺流程中废水的NH₄⁺-N、TP、COD和TN去除效果如图 4所示.由图 4可知,Pseudomonas flava WD-3的固定化小球在SBR工艺流程中对生活污水的处理效果很好,随着小球数量(含菌量5~20 mL)的增加,生活污水中NH₄⁺-N、TP、COD和TN的去除效率也随之增大.当含菌量在0~10 mL时,污水中各项指标的去除效果增幅明显,但达到10 mL以后,虽然各项污水指标去除效率依旧呈增大趋势,但增幅明显缩小,从实验操作、运行成本等各方面考虑宜选用含菌量为10 mL时为最佳固定化小球投加量.当固定化小球的投加量取最佳时,Pseudomonas flava WD-3的固定化小球对污水NH₄⁺、TP、COD和TN的去除率分别介于72.78%~77.48%、62.04%~69.26%、89.08%~92.72%和85.08%~89.08%,且平均去除效率分别为未投加该菌的1.13、1.91、1.25、1.56倍,固定化后,污水处理效果明显提升,与同类实验效果相吻合(Wang et al., 2015；武心华,2011)；并且相比先前实验中未固定化的低温菌Pseudomonas flava WD-3对污水的处理效果(Tang et al., 2015),去除效率明显增加.

图 4(Fig. 4)

图 4 不同投菌量时进出水中NH4+-N、TP、COD 和TN 浓度变化情况 Fig. 4 NH4+-N, TP, COD and TN concentration in inflow and outflow with different dosage strain

连续运行3个月,控制水温为6~8 ℃,在SBR工艺流程中不同的水力停留时间对废水的NH₄⁺-N、TP、COD和TN去除效果如图 5所示.由图 5可知,取最佳固定化小球投加量时,随着水力停留时间(HRT)的延长(0~10 h),Pseudomonas flava WD-3的固定化小球在SBR工艺流程中对生活污水中COD、TN、NH₄⁺-N和TP的去除效率也随之增大.当水力停留时间由0 h延长至8 h时,SBR工艺流程中各项污水指标的去除效果增幅明显,但超过8 h之后,虽然各项污水指标去除效率依旧呈增大趋势,但增幅明显缩小,从实验操作、运行成本等各方面考虑宜选用8 h为最佳水力停留时间.当水力停留时间为8 h时,Pseudomonas flava WD-3的固定化小球对污水NH₄⁺-N、TP、COD和TN的去除率分别介于66.54%~75.61%、63.24%~73.68%、89.78%~91.03%和82.84%~87.26%.

图 5(Fig. 5)

图 5 不同水力停留时间时进出水中NH4+-N、TP、COD 和TN浓度变化情况 Fig. 5 NH4+-N, COD, TP and TN concentration in inflow and outflow with different hydraulic retention time

随着在低温菌方面的深入研究及微生物固定化技术的不断成熟,必将改善寒冷地区在低温条件下处理污水困难的局面,固定化低温菌也将在城市污水处理、湿地处理污水、废水环境改善再利用方面发挥更大的作用.

在SBR运行系统中,低温菌Pseudomonas flava WD-3对污水中污染物质的代谢降解即污染物质的衰减,可用一级动力学方程(US EPA,1988；Kadlec,2000;2003)来模拟其降解效率：

式中,C_e为出水浓度(mg·L^-1),C为进水浓度(mg·L^-1)；t为水力停留时间(h)； K_T为某温度下的一阶反应速率.

在SBR运行系统中,污水中各个指标去除率的一阶方程描述(Nitisoravut et al., 2005)如下：

式中,R₀为污水污染指标NH₄⁺、TP、COD和TN的去除率；Q为水力负荷(m³·h^-1)；A为SBR运行面积(m²)；F为污染物质的非生物降解比例.

根据上述动力学模型,将SBR系统中各污染物的平均出水浓度记作C_e,平均进水浓度记作C,以ln(C_e/C)为纵坐标,分别以不同投菌量(HRT为8 h),不同水力停留时间(投菌量为10 mL)为横坐标做图,结果如图 6所示；以lnR₀为纵坐标,再以不同投菌量(HRT为8 h),不同水力停留时间(投菌量为10 mL)为横坐标做图,结果如图 7所示.

图 6(Fig. 6)

图 6 6~8 ℃下SBR系统在不同投菌量(a)和不同水力停留时间(b)条件下对有机污染物降解的一级动力学模型 Fig. 6 First-order degradation of organic matter with various Pseudomonas flava WD-3 concentrations(a) and HRTs(b) in the SBR units operated under 6~8 ℃

图 7(Fig. 7)

图 7 6~8 ℃下SBR系统中污染物去除效率与投菌量(a)、水力停留时间(b)的关系 Fig. 7 Relation of lnR0 to various Pseudomonas flava WD-3 concentrations(a) and HRTs(b) in SBR units operated under 6~8 ℃

通过对SBR运行系统进行监测,在不同投菌量和不同水力停留时间条件下对污染物降解效率进行分析,在6~8 ℃低温环境中,低温菌Pseudomonas flava WD-3 对生活污水污染指标NH₄⁺-N、TP、COD、TN的降解效率符合一级动力学模型.

由图 6可得出如下方程式：

式中,k为污水污染指标的降解速率常量(h^-1),b为污水污染指标降解趋势线斜率,结果如表 4所示.以上一级动力学方程表明,不同投菌量和水力停留时间(HRT)分别与降解效率的函数关系影响SBR的系统性能,进一步说明在低温条件下,低温菌Pseudomonas flava WD-3 对生活污水污染指标NH₄⁺-N、TP、COD和TN的去除效率符合一级动力学模型,并且其去除效率与投菌量和水力停留时间(HRT)成正向关系,R²值均在0.85以上.

表 4(Table 4)

表 4 在6~8℃低温环境下NH4+-N、TP、COD和TN的降解速率常量k和非生物降解残余部分比例F Table 4 The overall rate constant (k) and F about NH4+、TP、COD and TN in SBR units operated under 6~8 ℃

表 4 在6~8℃低温环境下NH4+-N、TP、COD和TN的降解速率常量k和非生物降解残余部分比例F Table 4 The overall rate constant (k) and F about NH4+、TP、COD and TN in SBR units operated under 6~8 ℃ 指标 k/h-1 F NH4+-N 0.2084 0.813 TP 0.2018 0.838 COD 0.3517 0.448 TN 0.2073 0.439

1)对于Pseudomonas flava WD-3,最佳的优化条件为：SA质量分数4%,PVA质量分数6%,固定化液(CaCl₂)质量分数5%,交联时间24 h,此时固定化小球在低温条件下对模拟废水中COD、氨氮、总磷、总氮的去除效率分别为69.79%、57.54%、66.07%、64.79%,分别是游离菌对COD、TP和NH₄⁺-N去除效率的1.11、1.17、1.14倍.

2)Pseudomonas flava WD-3在最优化条件下制备的固定化小球投加到连续运行的SBR工艺流程中,通过试验监测,10 mL菌悬液制备的固定化小球为试验最佳投加量,对污水中COD、氨氮、总磷、总氮的去除率分别介于72.78%~77.48%、62.04%~69.26%、89.08%~92.72%和85.08%~89.08%；在最佳投加量条件下,SBR工艺中水力停留时间越长处理效果越好,综合考虑取取最佳水力停留时间为8 h,对污水中COD、氨氮、总磷、总氮的去除率分别介于66.54%~75.61%、63.24%~73.68%、89.78%~91.03%和82.84%~87.26%.

3)在SBR工艺流程中,Pseudomonas flava WD-3 对生活污水中各污染物NH₄⁺-N、TP、COD和TN的降解效率符合一级动力学模型.