溶解性有机物(Dissolved Organic Matter，DOM)是陆地生态系统中极为活跃的有机组分，是土壤圈层与相关圈层(如生物圈、大气圈、水圈和岩石圈)发生物质交换的重要形式，也是影响土壤形成、矿物风化和污染物迁移的重要因素之一，在碳、氮、磷和硫等营养元素的地球生物化学过程、成土过程、微生物的生长代谢过程、土壤有机质分解过程及土壤中污染物的迁移中有重要作用(刘微等，2011).它还影响环境的酸碱特性、营养物质的有效性、污染物质的环境行为特性(如污染物质的毒性、迁移转化特性及生物可降解性等)(陈同斌等，1998)；同时，DOM 与水体富营养化及温室气体的排放也有着密切的联系(沈宏等，1999).DOM在土壤中的动态变化不但与其来源密切相关，也受陆地生态系统中各种环境条件变化的影响.东北地区位于我国温带湿润、半湿润季风气候区，土壤具有季节冻结和融化的过程.秋-冬和冬-春交替季节是土壤季节性冻融过程发生强烈的时期.冻融作用可使土壤的物理、化学和生物性质发生明显的变化(Fitzhugh et al.，2001；Joseph et al.，2008)，如使土壤的疏松度增加，促进有机物质和细菌的接触及增强酶的活化效应，加强有机物的矿化作用等(王洋等，2007).以往的研究多是围绕冻融交替对温室气体的排放、土壤的物理性质、土壤微生物、土壤氮和碳矿化作用的影响而展开的(Freppaz et al.，2007).关于冻融作用对土壤中DOM的影响的研究虽然较少，但仍有成果报道.刘淑霞等(2008)考察了冻融作用下黑土有机碳数量的变化，发现冻融交替对黑土总有机碳及易氧化有机碳影响不大，但对于溶解性有机碳(Dissolved Organic Carbon，DOC)的影响较大；汪太明等(2011)利用三维荧光分析交替冻融对黑土DOM光谱特性的影响，并基于光谱特征的改变，评价了交替冻融对黑土活性腐殖质和腐殖化程度的影响.他们认为交替冻融能够引起黑土和暗棕壤腐殖化程度加大，水稻土则相反(汪太明等，2011).王恩姮等(2010)研究了季节性冻融对典型黑土区土壤团聚体特征的影响，发现典型黑土区季节性冻融增强了土壤团聚体的水稳定性.然而，目前关于冻融处理参数对土壤中DOM光谱学特性的影响的研究还较少.因此，本文以受季节性冻融过程影响显著的辽宁省的棕壤、暗棕壤为研究对象，考察冻结温度、融化温度、冻结时间和冻融次数对土壤中DOM光谱学特性的影响.研究成果有助于人们了解季节性冻融条件下土壤中DOM的变化规律，为增加土壤DOM的固定，提高土壤肥力，减少温室气体的排放，改善生态环境提供理论依据；还可以为土壤生态环境、地表水流域环境等的研究做出资料的积累；同时，对于合理利用DOM对土壤污染进行控制与修复具有重要的指导作用.

采样点分别位于辽宁省沈阳市苏家屯区陈相村(41°30′36″N，123°30′12″E)和沈阳市沈北新区石佛村(42°6′18″N，123°18′18″E).沈阳市位于中国东北地区，辽宁中部，以平原为主，属温带半湿润地区，全年气温在-35~36 ℃之间，受季风影响，温差较大，四季分明，土壤类型以棕壤、暗棕壤为主.2014年3月中旬，分别在陈相村和石佛村采样点采集0~15 cm的表层棕壤、暗棕壤土样各10 kg，装入塑料袋中带回，采样工具为铁铲，土壤样品性质见表 1.

表 1(Table 1)

表 1 土壤样品性质 Table 1 Characteristics of soil samples

表 1 土壤样品性质 Table 1 Characteristics of soil samples 土壤类型 pH 电导率/(μS·cm-1) DOC/(mg·kg-1) UV-254/cm-1 棕壤(CX) 6.13 506.1 61.88 0.07 暗棕壤(SF) 5.89 573.9 56.24 0.13

将采集的暗棕壤、棕壤剔除杂物后混匀，分别平均分成15份，棕壤样品记为CX0~CX14，暗棕壤样品记为SF0~SF14.CX0与SF0为对照样品，不做冻融处理，其余1~14号样品分为4组.第一组1~3号样品冷冻温度不同，冷冻温度分别设为-26、-20及-14 ℃，融化温度均设为15 ℃.第二组4~5号样品融化温度不同，融化温度分别为4 ℃和15 ℃，冷冻温度都设为-20 ℃.第三组6~10号样品冷冻时间不同，冷冻时间分别设为1、5、10、17、30 d，冷冻温度均设为-20 ℃，融化温度设为15 ℃.第四组11~14号样品冻融次数不同，冻融次数分别设为1、3、5、10次，冷冻温度都设为-20 ℃，融化温度设为15 ℃.该组实验中每个冻-融循环中冻结和融化各24 h，即2 d为一个冻融周期.经冻融处理后的样品在阴凉处风干，研磨，过2 mm筛.将筛下样品以40 g土∶300 mL蒸馏水的比例进行稀释溶解，恒温磁力搅拌0.5 h，静置24 h后上清液过0.45 μm滤膜，用棕色玻璃瓶收集后，置于4 ℃冰箱内保存.

DOC采用Shimadou TOC-5000(日本岛津公司)型总有机碳分析仪测定.

调节水样pH=7，然后将水样置于1 cm石英比色皿中，用紫外-可见分光光度计(Cary 50，美国Varian公司)进行紫外-可见吸收光谱扫描，扫描范围为190~900 nm，用高纯水作空白.

三维荧光光谱用CARY Eclipse EL0507-3920型分光荧光计(美国Varian公司)测定.测定荧光光谱时，将各个水样调节pH=7，以消除DOM的pH对荧光光谱的影响.用光程为1 cm的石英荧光比色皿盛装样品.三维荧光光谱图的激发波长扫描范围为220~400 nm，发射波长扫描范围为280~550 nm，激发和发射狭缝宽度均为5 nm，扫描速度为1200 nm·min^-1，扫描间隔为1 nm.同步荧光光谱的波长扫描范围为190~600 nm，所采用的扫描间隔为60 nm.

从图 1可以看出，暗棕壤与棕壤DOC含量不同，但变化规律相似.经冻融处理后，暗棕壤(SF)第一组1~3号样品冷冻温度由-26 ℃逐渐升高至-14 ℃，DOC含量随之升高，与对照样品SF0相比，DOC含量由未冻融时的61.88 mg·kg^-1依次变化为55.93、59.62、68.29 mg·kg^-1.棕壤(CX)第一组样品DOC含量依次变为45.97、48.45、59.34 mg·kg^-1，DOC含量随冷冻温度的升高呈增大趋势.SF与CX第二组样品融化温度由4 ℃变为15 ℃，DOC含量分别增多了2.86、11 mg·kg^-1.SF第三组样品在冷冻1 d后，其DOC含量与未冻融样品相比变大，之后随冷冻时间的增加而减少，在冷冻17 d后达到最小，为42.7 mg·kg^-1，之后呈上升趋势，到30 d时增加到79.58 mg·kg^-1.与未冻融样品相比，升高了22.2%.CX第三组样品DOC含量变化规律与SF相似，但DOC含量最小值出现在10 d左右，之后逐渐升高.与未冻融时相比，CX10样品DOC含量升高了21.2%.第四组11~14号样品随冻融次数增多，SF样品在第一次冻融后DOC含量变大，之后逐渐减少至41.02 mg·kg^-1，降低了33.7%；CX14样品在经过10次冻融循环以后，DOC含量由未冻融时的56.24 mg·kg^-1减少至39.87 mg·kg^-1，减少了29.1%.由实验结果分析可知，冻融作用改变了土壤结构，大分子难溶有机物暴露出来被微生物降解成可溶性有机物(曹军等，1999)；过低的冷冻温度冻死了土壤中部分微生物，使微生物量碳转化为可溶性有机碳，从而使可溶性有机碳含量增加(汪太明等，2011).冻融作用改变了土壤结构，细根死亡导致土壤中活性物质的输入，适宜的冻融温度提高了微生物的活性，从而使土壤中易分解的有机碳含量增加(刘淑霞等，2008).低温使土壤中不耐寒的微生物致死，同时，冻融作用使与土壤结合的大分子量有机碳中氢键破裂或引起土壤与有机碳结合部位的破坏，微生物量碳就被溶解释放出来.耐寒微生物随着冻融次数的增加而逐渐增多，DOC逐渐被分解转化，因而土壤中DOC含量逐渐减少.

图 1(Fig. 1)

图 1 不同冷冻温度(a)、不同融化温度(b)、不同冷冻时间(c)、不同冻融次数(d)条件下冻融导致的土壤中DOC含量的变化 Fig. 1 Changes in DOC in soil caused by freezing-thawing treatments with different freezing temperatures(a), different thawing temperatures(b), different freezing time(c), and different times of freezing-thawing cycles(d)

DOM对光的吸收特性可通过紫外-可见吸收光谱等光谱学手段进行表征(Mladenov et al.，2010).DOC浓度可以提供DOM的定量信息(Mann et al.，2012)，而光谱学性质则可提供定性信息(Inamdar et al.，2012).由于DOM组分结构复杂(吴志皓等，2005)，多种官能团相互干扰，其紫外-可见吸收光谱均无明显特征吸收峰.

UV-254是指在波长为254 nm处的单位比色皿光程下的紫外吸光度，其值能够反映所测样品中腐殖质类大分子有机物及含CC双键和CO双键的芳香族化合物的多少(Leenheer et al.，2003).SUVA可以反映出水中有机物的某些特性，如芳香性及不饱和双键或芳香环有机物的相对含量的多少等(Leenheer et al.，2003).Nishijima等(2004)研究认为，有机物在254 nm下的紫外吸收主要代表包括芳香族化合物在内的具有不饱和碳碳键的化合物，相同DOC浓度的有机质在该波长下吸光值的增加意味着非腐殖质向腐殖质的转化.E₂/E₃为波长在250 nm和365 nm处的吸光比(李鸣晓等，2010)，该比值可以很好地反映DOM的腐殖酸的腐殖化、团聚化程度和分子量分布状况(Wang et al.，2009)，E₂/E₃越大，DOM的分子量越小.有研究表明，富里酸(FA)的E₂/E₃值在4左右(Barreto et al.，2004)，胡敏酸(HA)的E₂/E₃值要比富里酸(FA)低(Wang et al.，2009).

从图 2及图 3的CX与SF中的UV-254、SUVA及E₂/E₃结果可以看出，CX与SF第一组1~3号样品UV-254与SUVA值变化趋势一致，呈增大趋势，这说明DOC 的增加幅度不如UV-254的增加幅度明显.CX与SF的E₂/E₃值都在2号样品达到最低，说明该冷冻温度下，DOM分子量达到最大.第二组4~5号样品UV-254与SUVA变大，说明5号样品与4号相比，该条件下芳香性物质含量增多，腐殖质转化增多.CX与SF的4号及5号样品E₂/E₃值与对照组相比均下降，由4.13降至3.4、3.4.这说明适宜的融化温度能使土壤中富里酸(FA)不同程度地向胡敏酸(HA)转化.第三组6 ~10号样品UV-254与SUVA随冷冻时间的增长先逐渐减少，后增大，而E₂/E₃值大致保持动态平衡，这说明土壤微生物在长时间的冷冻环境下有了耐寒性，降解与产生芳香性物质与腐殖质达到平衡状态.第四组11~14号样品UV-254与SUVA随冻融次数的增加逐渐减小.这可能说明循环冻融激发了微生物的降解活性，改变了腐殖质类物质的稳定性，导致腐殖质类物质不断向非腐殖质类物质转化与芳香性物质的减少.E₂/E₃的值却随冻融次数的增加而呈现增大趋势，这说明土壤DOM中分子量不同程度的减少，这与冻融作用激发了微生物的降解活性这一结论不谋而合.

图 2(Fig. 2)

图 2 不同冷冻温度(a)、不同融化温度(b)、不同冷冻时间(c)、不同冻融次数(d)条件下冻融导致的CX中的UV-254、SUVA、E2/E3值的变化 Fig. 2 Changes in values of UV-254, SUVA, E2/E3 in CX caused by freezing-thawing treatments with different freezing temperatures(a), different thawing temperatures(b), different freezing time(c), and different times of freeze-thaw cycles(d)

图 3(Fig. 3)

图 3 不同冷冻温度(a)、不同融化温度(b)、不同冷冻时间(c)、不同冻融次数(d)条件下冻融导致的SF中的UV-254、SUVA、E2/E3值的变化 Fig. 3 Changes in values of UV-254, SUVA, E2/E3 in SF caused by freezing-thawing treatments with different freezing temperatures(a), different thawing temperatures(b), different freezing time(c), and different times of freeze-thaw cycles(d)

三维荧光光谱是表征滤液DOM的重要参数，它能有效反映多组分复杂体系的物质组成(席北斗等，2009).三维荧光光谱比起普通的荧光光谱能够获得激发波长和发射波长同时变化时的荧光强度信息，可对多组分复杂体系中荧光光谱重叠的对象进行光谱表征(傅平青等，2005).图 4各样品的三维荧光谱图显示有3个显著荧光峰和一片“肩峰”.第1个峰在激发波长/发射波长(λ_Ex/λ_Em)=295~330 nm/411~434 nm区域内，是类腐殖酸荧光峰；第2个荧光峰在λ_Ex/λ_Em=245~260 nm/405~440 nm区域内，是类富里酸荧光峰；第3个峰分布在λ_Ex/λ_Em=280 nm/316~348 nm区域内，是类溶解性微生物代谢产物荧光峰.第4个峰分布在激发波长＜240 nm的区域内，是类芳香族蛋白质荧光峰，但在本次实验中以“肩峰”形式存在.以上4个荧光区域中均有相应荧光峰出现，但类富里酸荧光峰及类腐殖酸荧光峰较为明显.这两类荧光峰来源于土壤DOM的腐殖化过程，其强弱和峰位置与腐殖质的腐殖化程度有关(席北斗等，2009)，同时反映了外源有机碳的存在，而类溶解性微生物荧光峰反映了内源性有机碳的存在(郭瑾等，2007).表 2给出了未冻融样品和经不同冻融处理后样品各主要荧光峰位置和强度.由图 4和表 2可以看出，CX和SF土壤样品中以外源性有机物为主.

图 4(Fig. 4)

图 4 不同冻融处理前后各样品中DOM的三维荧光谱图 Fig. 4 Three-dimensional fluorescence spectra of DOM in each sample before and after different freezing-thawing treatments

表 2(Tab. 2)

表 2 不同冻融处理前后各样品中DOM荧光峰的位置和强度 Table 2 Position and intensity of fluorescence peaks of DOM in each sample before and after different freezing-thawing treatments

表 2 不同冻融处理前后各样品中DOM荧光峰的位置和强度 Table 2 Position and intensity of fluorescence peaks of DOM in each sample before and after different freezing-thawing treatments 样品 类腐殖酸荧光峰 类富里酸荧光峰 类溶解性微生物代谢产物荧光峰 λEx/λEm/nm Intensity(a.u.) λEx/λEm/nm Intensity(a.u.) λEx/λEm/nm Intensity(a.u.) CX0 335/423 54.2 240/416 72.4 280/317 44.5 SF0 335/432 79.8 240/434 124.7 285/329 37.5 CX1 325/420 60.3 240/426 78.8 285/328 50.4 CX2 335/428 61.3 240/437 98.6 285/325 25.7 CX3 320/421 64.4 240/423 85.0 280/315 52.3 SF1 325/420 92.9 240/430 122.6 SF2 325/423 93.4 240/427 118.9 SF3 330/429 110.3 240/428 149.4 290/328 62.45 CX4 335/428 61.3 240/437 98.6 285/325 25.7 CX5 325/424 62.3 240/422 87.5 285/322 40.7 SF4 325/423 93.4 240/427 118.9 SF5 335/425 109.4 240/427 152.8 285/330 57.9 CX6 325/424 62.3 240/422 87.5 285/322 40.7 CX7 330/415 53.0 280/420 53.4 280/319 39.3 CX8 330/424 41.7 240/420 57.4 285/323 33.3 CX9 330/417 44.3 240/424 60.6 285/323 33.8 CX10 325/422 45.2 240/431 67.3 285/321 33.9 SF6 335/425 109.4 240/427 152.8 285/330 57.9 SF7 330/425 79.3 230/424 124.2 285/328 45.1 SF8 325/426 77.9 230/424 119.8 270/308 31.1 SF9 330/429 63.6 240/433 95.9 285/322 29.0 SF10 325/426 75.8 240/423 110.6 285/331 43.6 CX11 325/424 62.3 240/422 87.5 285/322 40.7 CX12 325/419 50.1 240/424 76.2 285/322 32.1 CX13 325/420 44.2 240/423 65.3 285/324 26.6 CX14 325/421 43.6 240/425 64.7 285/324 25.6 SF11 335/425 109.4 240/427 152.8 285/330 57.9 SF12 330/424 79.0 230/424 131.5 285/331 31.7 SF13 335/425 68.9 240/427 100.1 285/323 31.3 SF14 335/425 65.0 240/436 98.2

图 4中1~5号样品反映了经过不同冻结和融化温度的冻融处理后，棕壤与暗棕壤中DOM的三维荧光光谱结果.与未冻融样品相比，CX和SF的1号样品在-14、4 ℃处理下样品各荧光峰首先发生了红移，在融化温度一定，冷冻温度逐渐降低的情况下，类腐殖酸及类富里酸荧光峰都发生红移，SF1、SF2样品中的类溶解性微生物代谢产物荧光峰消失(图 4和表 2)，可能是类富里酸荧光峰掩盖了此荧光峰.红移说明冻融过程中产生了新物质，土壤有机物芳香化程度增高，峰强变大；CX样品中的类溶解性微生物代谢产物荧光峰红移是由于冻融过程中产生了新物质，并形成新的荧光峰.它是由对应于高激发波长处的类色氨酸产生的(Baker et al.，2002).4、5号样品经-20、4 ℃处理后类腐殖酸和类富里酸荧光峰与未冻融样品相比均发生了蓝移.研究表明(张会平等，2006)，荧光峰蓝移，也就是说短发射波长和高荧光强度与芳环上的给电子取代基(如羟基和甲氧基)有关，因为这些给电子基增加了基态和第一激发态之间的能量差.相反，长激发波长和低荧光值与芳环上的吸电子基(如羰基和羧基)有关.

CX及SF的6 ~10号样品反映了经过不同冷冻时长的冻融处理后，土壤中DOM的三维荧光光谱结果.由结果可以看出，经过不同冷冻时长处理后，各荧光峰强度呈现先减小后增大的趋势.在冷冻10 d后，CX8类富里酸荧光峰和类溶解性微生物代谢产物荧光峰的强度达到最低(图 4和表 2).SF10在冷冻30 d后，与未冻融样SF0相比，类腐殖酸荧光峰、类富里酸荧光峰和类溶解性微生物代谢产物荧光峰强度由原来的79.8、124.7、37.5变为75.8、110.6、43.6，由此可以看出，类腐殖酸和类富里酸荧光物质减少，而类溶解性微生物代谢产物荧光物质增多.这可能说明冷冻初期，不耐寒微生物被冻死，微生物体内溶解性有机质被释放，造成各荧光物质先升高，随着冷冻时间的变长，耐寒微生物逐渐适应，并进行繁殖，继续分解土壤中溶解性有机质，不断产生代谢产物.因而造成类腐殖酸和类富里酸荧光峰的蓝移，类溶解性微生物代谢产物的红移.

CX及SF的11~14号样品反映了经过不同冻融次数的冻融处理后，土壤中DOM的三维荧光光谱结果.从图 4可以看出，第一次冻融之后CX11与SF11样品各荧光峰强度均比未冻融样品的荧光峰强度增大，随着循环冻融次数的增多，样品各荧光峰强度逐渐降低.CX14在经冻融循环10次以后，其类腐殖酸荧光峰位置由λ_Ex/λ_Em=335 nm/423 nm蓝移至λ_Ex/λ_Em=425 nm /421 nm；结合表 2可以发现，荧光峰强度降低至43.6，与未冻融时的54.2相比，降低了19.9%；同时，类富里酸荧光峰位置由λ_Ex/λ_Em=240 nm /416 nm红移至λ_Ex/λ_Em=240 nm /425 nm，荧光峰强度与未冻融时相比则降低了11.9%.SF14经10次冻融循环以后，类腐殖酸荧光峰强度与未冻融时相比，降低了18.6%，类富里酸荧光峰强度则降低了21.2%.SF14样品类溶解性微生物代谢产物荧光峰消失，这可能是由于类芳香族蛋白质荧光峰变强，掩盖了此处荧光峰的形成.SF14在λ_Ex/λ_Em=230 nm /425 nm处产生新峰，该荧光峰属于类富里酸荧光峰.该现象可能表明了循环冻融能促进微生物代谢活性，将相对稳定、高分子量的芳香性类物质逐渐分解转化为低分子量、高荧光效率的有机物质.

三维荧光光谱包含了DOM的全部指纹，但由于DOM的组成非常复杂，多种组分的荧光光谱发生重叠，对三维荧光光谱中包含的DOM结构的潜在信息进行识别比较困难.而同步荧光法具有选择性好、干扰少、谱图简化、灵敏度高等特点，尤其适合对多组分混合物的分析(陈女等，2006).

同步荧光法在扫描过程中使激发波长和发射波长彼此间保持固定的波长间隔(Δλ=λ_Em-λ_Ex=常数)，在同步荧光法中，Δλ的选择十分重要，这将直接影响到同步荧光光谱的形状、带宽和信号强度.准确选择某种成分的Δλ能够极大地提高同步荧光光谱对多组分复杂体系中该成分的选择性(Chen et al.，2003;Alberts et al.，2004).本次试验Δλ=60 nm.

由图 5可以看出，各样品DOM同步荧光谱图中均显示两个显著的特征峰Ⅰ(λ_syn=280~300 nm)和峰Ⅱ(λ_syn=330~350 nm).与三维荧光谱图比较可知，峰Ⅰ位于类溶解性微生物代谢产物荧光区，Alberts等(2004)认为该峰表示的是芳香性氨基酸(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)类物质及含有芳香性氨基酸的蛋白质.峰Ⅱ位于类腐殖酸荧光区，从图 5可以看出，各样品同步荧光谱图中该峰为主要荧光峰，这与三维荧光谱图中所反映的类腐殖酸荧光物质为主要荧光物质一致.在第三、四组实验中，CX与SF在λ_syn=380~400 nm处均可以观察到一片“肩峰”，该峰表示的是含有稠环结构的芳香性物质，而其他两组在该处的荧光信号较弱，这说明长时间冻结及循环冻融更易使土壤DOM中产生含有稠环结构的芳香性物质.图 5第一组与第二组中峰Ⅱ与三维荧光谱图中类腐殖酸荧光峰变化规律不同，可能是因为温度变化幅度较小，样品DOM荧光物质含量变化规律不明显，别的荧光峰“隐藏”了该峰结构特性信息的显示.第三组、第四组峰Ⅱ的变化规律与三维荧光谱图类腐殖酸荧光峰的变化规律相似，长时间冻结及循环冻融对土壤DOM中各荧光物质影响较为显著，因而呈现相似规律.

图 5(Fig. 5)

图 5 不同冻融处理前后各样品中DOM的同步荧光谱图 Fig. 5 Synchronous fluorescence spectra of DOM in each sample before and after different freezing-thawing treatments

1)冻融处理条件下，土壤中的DOC含量随冷冻及融化温度的升高而增大，随冷冻时间的延长而先减小后增大，随冻融次数的增多而减小.

2)冻融处理条件下，土壤中UV-254及SUVA的变化规律与DOC含量相似.冻融作用使DOM的腐殖化程度提高，分子量减小.

3)三维荧光光谱结果显示，随着冷冻时间的延长，DOM中类富里酸荧光物质和类腐殖酸荧光物质的含量先减少后增多，并能产生新的类溶解性微生物产物荧光物质；随着冻融次数的增多，DOM中荧光物质的含量逐渐减少.同步荧光光谱结果显示，长时间冻结及循环冻融更易使土壤DOM中产生含有稠环结构的芳香性物质.

责任作者简介: 薛爽(1977—)，女，副教授(博士)，主要研究方向为低温环境中污染物的地球化学行为.E-mail: xueshuang666@sina.com.cn.